Лабораторно конструираните плазмиди, работен кон на съвременната биология, имат проблеми. Изследователите проведоха систематична оценка на кръгови ДНК структури, като анализираха повече от 2500 плазмиди, направени в лаборатории и изпратени на компания, която предоставя услуги като опаковане на структурите във вируси, така че да могат да се използват като генни терапии. Екипът установи, че почти половината от плазмидите имат грешки в дизайна, включително грешки в последователности, критични за експресията на терапевтичен ген. Изследователите публикуваха своите резултати миналия месец на предпечатния сървър bioRxiv 1.

Проучването разкрива "липса на знания" за провеждането на подходящ контрол на качеството на плазмидите в лабораторията, казва Хироюки Накай, генетик от Университета по здравеопазване и наука в Орегон, който не е участвал в работата. Той вече беше забелязал проблеми с лабораторно произведени плазмиди, но беше изненадан от честотата на грешките, открити от изследването. Вероятно има много публикувани научни статии, за които резултатите не са възпроизводими поради грешки в дизайна на плазмида, добавя той.

Загубено време

Плазмидите са популярни инструменти в биологичните лаборатории, като бактерии, включително широко използвания модел на организъмЕшерихия коли, които използват структури за съхранение и обмен на гени. Това означава, че биолозите могат да създадат дизайнерски плазмиди, които съдържат различни интересни гени, и след товаE.coliубедете ги да ги запишат и да направят много копия от тях.

Брус Лан, главен учен във VectorBuilder, базирана в Чикаго, Илинойс компания, която предоставя инструменти за доставяне на гени, казва, че той и други биолози са забелязали проблеми с качеството на плазмидите от години. Когато Лан беше професор в Чикагския университет, един студент в неговата лаборатория прекара шест месеца, възпроизвеждайки два плазмида, за които се съобщава в научната литература. „Не помислихме за качеството на плазмидите, но тогава експериментът не проработи“, защото плазмидите съдържаха грешки, казва той.

Сега във VectorBuilder, Лан казва, че вижда проблема през цялото време - затова е решил систематично да го оцени. Когато клиентите предоставят дефектни плазмиди, „те губят много време“, а допълнителните стъпки в контрола на качеството увеличават разходите за производство на плазмидите и опаковането им във вируси, казва той.

Анализът на екипа на VectorBuilder разкри смесица от грешки в повече от 2500 оценени плазмида. Някои съдържат гени, които кодират протеини, отговорни заE.coliса токсични, което означава, че могат да забавят или спрат растежа на организмите, на които биолозите разчитат, за да възпроизведат своите плазмиди. Други, предназначени за опаковане във вируси, кодират протеини, които са токсични за тези вируси. А някои съдържат повтарящи се ДНК последователности, които могат да натрупват мутации в плазмидите.

Проверка на грешки

Най-честите грешки, открити от Лан и колегите му, са свързани с ключов инструмент за генна терапия. Терапиите често са опаковани в адено-асоциирани вируси (AAV), които са предимно безвредни и могат да доставят лечение на клетките. Когато създават плазмидите за тези AAVs, изследователите поставят терапевтичен ген между последователности, наречени ITRs, които играят критична роля за гарантиране, че генът е опакован във вируса за доставка. Тези последователности по същество изпращат биологичен сигнал до клетките, който казва „Аз принадлежа към този вирус“. Екипът обаче установи, че около 40% от AAV плазмидите в изследването имат мутации в ITR регионите, които биха могли да изкривят това важно съобщение. Ако изследователите са използвали тези неправилно проектирани плазмиди, тяхната генна терапия може да не работи - и може да отнеме много време на учените, за да разберат защо.

Марк Кей, специалист по педиатрия и генетика в Станфордското училище по медицина в Калифорния, също е видял от първа ръка, че грешките в плазмидите могат да забавят лабораторните проекти. Той обаче е уверен, че учените могат да идентифицират и коригират тези грешки. Той казва, че изследователите на генната терапия са наясно с възможни проблеми с ITR и че грешките са малко вероятни в клинични условия. Това е така, защото регулаторните агенции като Американската администрация по храните и лекарствата имат строги стандарти, които изискват от изследователите внимателно да анализират своите плазмиди, преди да ги използват в клиниката.

Накаи казва, че проверката на плазмидите за грешки чрез секвениране може да предупреди изследователите за проблемите, подчертани в изследването. Някои компании, включително Plasmidsaurus в Юджийн, Орегон, и Elim Biopharmaceuticals в Хейуърд, Калифорния, предлагат плазмидно секвениране за около $15,00 на проба, казва Накай, който няма финансов интерес в нито една от двете компании. Той също така препоръчва на новите членове на лабораторията да отделят време за учене от опитни дизайнери на плазмиди; Това е трудоемък, ръчно изработен процес, казва той, но ако направите грешка, може да загубите огромно количество време и пари.

Друг начин за лабораториите да избегнат проблеми е да направят своите плазмидни последователности публично достъпни в хранилища с отворен достъп, казва Мелина Фан, главен научен директор в организацията с нестопанска цел Addgene в Уотъртаун, Масачузетс. Addgene предоставя такова хранилище, казва Fan, и то „последователно подрежда депозираните плазмиди и споделя данните за последователността чрез уебсайта за използване от общността“. Проверката на плазмидите е важна, добавя тя.

Лан се надява, че анализът на екипа му привлича вниманието на изследователите към факта, че тези лабораторни инструменти за работен кон често се приемат за даденост. „Здравето на инструмента е нещо, за което хората не мислят“, казва той, въпреки че трябва.