Laboratorně upravené plazmidy, tahouni moderní biologie, mají problémy. Výzkumníci provedli systematické hodnocení kruhových struktur DNA analýzou více než 2 500 plazmidů vyrobených v laboratořích a zaslaných společnosti, která poskytuje služby, jako je balení struktur do virů, aby je bylo možné použít jako genové terapie. Tým zjistil, že téměř polovina plazmidů měla chyby v návrhu, včetně chyb v sekvencích kritických pro expresi terapeutického genu. Výzkumníci zveřejnili své výsledky minulý měsíc na předtiskovém serveru bioRxiv 1.

Studie odhaluje „nedostatek znalostí“ o provádění řádné kontroly kvality plazmidů v laboratoři, říká Hiroyuki Nakai, genetik z Health & Science University v Oregonu, který se na práci nepodílel. Už si všiml problémů s plazmidy vyrobenými v laboratoři, ale byl překvapen četností chyb, které studie odhalila. Pravděpodobně existuje mnoho vědeckých prací, které byly publikovány, jejichž výsledky nejsou reprodukovatelné kvůli chybám v designu plazmidu, dodává.

Ztracený čas

Plazmidy jsou populární nástroje v biologických laboratořích, jako bakterie, včetně široce používaného modelového organismuEscherichia coli, které využívají struktury k ukládání a výměně genů. To znamená, že biologové mohou vytvořit designové plazmidy, které obsahují různé geny zájmu, a pakE.colipřesvědčit je, aby je zaznamenali a udělali z nich mnoho kopií.

Bruce Lahn, hlavní vědec ve společnosti VectorBuilder, společnosti se sídlem v Chicagu v Illinois, která poskytuje nástroje pro dodávání genů, říká, že on a další biologové si již léta všimli problémů s kvalitou plazmidu. Když byl Lahn profesorem na univerzitě v Chicagu, postgraduální student v jeho laboratoři strávil šest měsíců reprodukcí dvou plazmidů, které byly popsány ve vědecké literatuře. "Nepřemýšleli jsme o kvalitě plazmidů, ale pak experiment nefungoval", protože plazmidy obsahovaly chyby, říká.

Nyní ve společnosti VectorBuilder Lahn říká, že problém vidí neustále – a tak se rozhodl jej systematicky vyhodnocovat. Když zákazníci předloží vadné plazmidy, „ztrácejí spoustu času“ a dodatečné kroky v kontrole kvality zvyšují náklady na výrobu plazmidů a jejich zabalení do virů, říká.

Analýza týmu VectorBuilder odhalila spoustu chyb ve více než 2 500 hodnocených plazmidech. Některé obsahovaly geny, které kódovaly zodpovědné proteinyE.colibyly toxické, což znamená, že by mohly zpomalit nebo zastavit růst organismů, na které biologové spoléhají při replikaci svých plazmidů. Jiné, určené pro balení do virů, kódovaly proteiny, které byly pro tyto viry toxické. A některé obsahovaly opakující se sekvence DNA, které mohou akumulovat mutace v plazmidech.

Kontrola chyb

Nejčastější chyby, které Lahn a jeho kolegové našli, souvisely s klíčovým nástrojem genové terapie. Terapie jsou často zabaleny do adeno-asociovaných virů (AAV), které jsou většinou neškodné a mohou poskytnout léčbu buňkám. Při vytváření plazmidů pro tyto AAV vědci vkládají terapeutický gen mezi sekvence nazývané ITR, které hrají klíčovou roli při zajišťování toho, aby byl gen zabalen do viru pro doručení. Tyto sekvence v podstatě posílají do buněk biologický signál, který říká „patřím do tohoto viru“. Tým však zjistil, že asi 40 % AAV plazmidů ve studii mělo mutace v oblastech ITR, které by mohly tuto důležitou zprávu zkreslit. Pokud by výzkumníci použili tyto špatně navržené plazmidy, jejich genová terapie by nemusela fungovat – a vědcům by mohlo trvat dlouho, než zjistí proč.

Mark Kay, specialista na pediatrii a genetiku na Stanford School of Medicine v Kalifornii, také z první ruky viděl, že chyby plazmidu mohou zpozdit laboratorní projekty. Je však přesvědčen, že vědci mohou tyto chyby identifikovat a opravit. Říká, že výzkumníci genové terapie jsou si vědomi možných problémů ITR a že chyby jsou v klinickém prostředí nepravděpodobné. Je to proto, že regulační agentury, jako je US Food and Drug Administration, mají přísné normy, které vyžadují, aby výzkumníci pečlivě analyzovali své plazmidy před jejich použitím na klinice.

Nakai říká, že kontrola chyb v plazmidech prostřednictvím sekvenování by mohla upozornit výzkumníky na problémy, na které studie upozornila. Některé společnosti, včetně Plasmidsaurus v Eugene, Oregon, a Elim Biopharmaceuticals v Hayward, Kalifornie, nabízejí sekvenování plazmidů za přibližně 15,00 $ za vzorek, říká Nakai, který nemá žádný finanční zájem v žádné společnosti. Rovněž doporučuje, aby noví členové laboratoře strávili čas učením se od zkušených konstruktérů plazmidů; Je to pracný, ručně vyrobený proces, říká, ale pokud uděláte chybu, může to ztratit obrovské množství času a peněz.

Dalším způsobem, jak se laboratoře vyhnout problémům, je zpřístupnit své plazmidové sekvence veřejnosti v úložištích s otevřeným přístupem, říká Melina Fan, hlavní vědecká ředitelka neziskové organizace Addgene ve Watertown, Massachusetts. Addgene poskytuje takové úložiště, říká Fan, a „sekvenuje uložené plazmidy a sdílí data o sekvenci prostřednictvím webové stránky pro komunitní použití“. Kontrola plazmidů je důležitá, dodává.

Lahn doufá, že analýza jeho týmu přitáhne pozornost výzkumníků k faktu, že tyto laboratorní nástroje jsou často považovány za samozřejmost. „Zdraví nástroje je něco, o čem lidé nepřemýšlejí,“ říká, i když by měli.