Τα εργαστηριακά κατασκευασμένα πλασμίδια, ένα άλογο της σύγχρονης βιολογίας, έχουν προβλήματα. Οι ερευνητές διεξήγαγαν μια συστηματική αξιολόγηση κυκλικών δομών DNA αναλύοντας περισσότερα από 2.500 πλασμίδια που κατασκευάστηκαν σε εργαστήρια και εστάλησαν σε μια εταιρεία που παρέχει υπηρεσίες όπως η συσκευασία των δομών εντός των ιών, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γονιδιακές θεραπείες. Η ομάδα διαπίστωσε ότι σχεδόν τα μισά από τα πλασμίδια είχαν σφάλματα σχεδιασμού, συμπεριλαμβανομένων σφαλμάτων σε αλληλουχίες κρίσιμες για την έκφραση ενός θεραπευτικού γονιδίου. Οι ερευνητές δημοσίευσαν τα αποτελέσματά τους τον περασμένο μήνα στον διακομιστή προεκτύπωσης bioRxiv 1.

Η μελέτη αποκαλύπτει «έλλειψη γνώσης» σχετικά με τη διεξαγωγή σωστού ποιοτικού ελέγχου των πλασμιδίων στο εργαστήριο, λέει ο Hiroyuki Nakai, γενετιστής στο Πανεπιστήμιο Υγείας & Επιστήμης στο Όρεγκον που δεν συμμετείχε στην εργασία. Είχε ήδη παρατηρήσει προβλήματα με τα εργαστηριακά πλασμίδια, αλλά εξεπλάγη από τη συχνότητα των σφαλμάτων που αποκαλύφθηκαν από τη μελέτη. Υπάρχουν πιθανώς πολλές επιστημονικές εργασίες που έχουν δημοσιευτεί για τις οποίες τα αποτελέσματα δεν μπορούν να αναπαραχθούν λόγω σφαλμάτων στον σχεδιασμό του πλασμιδίου, προσθέτει.

Χαμένος χρόνος

Τα πλασμίδια είναι δημοφιλή εργαλεία στα εργαστήρια βιολογίας, ως βακτήρια, συμπεριλαμβανομένου του ευρέως χρησιμοποιούμενου μοντέλου οργανισμούEscherichia coli, που χρησιμοποιούν δομές για την αποθήκευση και την ανταλλαγή γονιδίων. Αυτό σημαίνει ότι οι βιολόγοι μπορούν να δημιουργήσουν πλασμίδια σχεδιαστών που περιέχουν διάφορα γονίδια ενδιαφέροντος και στη συνέχειαE.coliπείστε τους να τα ηχογραφήσουν και να κάνουν πολλά αντίγραφά τους.

Ο Bruce Lahn, επικεφαλής επιστήμονας στο VectorBuilder, μια εταιρεία με έδρα το Σικάγο του Ιλινόις που παρέχει εργαλεία μεταφοράς γονιδίων, λέει ότι αυτός και άλλοι βιολόγοι έχουν παρατηρήσει προβλήματα με την ποιότητα του πλασμιδίου εδώ και χρόνια. Όταν ο Λαν ήταν καθηγητής στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο, ένας μεταπτυχιακός φοιτητής στο εργαστήριό του πέρασε έξι μήνες αναπαράγοντας δύο πλασμίδια που είχαν αναφερθεί στην επιστημονική βιβλιογραφία. «Δεν σκεφτήκαμε την ποιότητα των πλασμιδίων, αλλά μετά το πείραμα δεν λειτούργησε» επειδή τα πλασμίδια περιείχαν σφάλματα, λέει.

Τώρα στο VectorBuilder, ο Lahn λέει ότι βλέπει το πρόβλημα όλη την ώρα - έτσι αποφάσισε να το αξιολογήσει συστηματικά. Όταν οι πελάτες υποβάλλουν ελαττωματικά πλασμίδια, «χάνουν πολύ χρόνο» και τα επιπλέον βήματα στον ποιοτικό έλεγχο αυξάνουν το κόστος παραγωγής των πλασμιδίων και συσκευασίας τους σε ιούς, λέει.

Η ανάλυση της ομάδας του VectorBuilder αποκάλυψε ένα σωρό λάθη στα περισσότερα από 2.500 πλασμίδια που αξιολογήθηκαν. Ορισμένα περιείχαν γονίδια που κωδικοποιούσαν πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες γιαE.coliήταν τοξικά, που σημαίνει ότι μπορούσαν να επιβραδύνουν ή να σταματήσουν την ανάπτυξη των οργανισμών στους οποίους βασίζονται οι βιολόγοι για την αναπαραγωγή των πλασμιδίων τους. Άλλα, που προορίζονταν για συσκευασία σε ιούς, κωδικοποίησαν πρωτεΐνες που ήταν τοξικές για αυτούς τους ιούς. Και μερικά περιείχαν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που μπορούν να συσσωρεύσουν μεταλλάξεις σε πλασμίδια.

Έλεγχος σφαλμάτων

Τα πιο συνηθισμένα λάθη που βρήκαν ο Lahn και οι συνεργάτες του συνδέονταν με ένα βασικό εργαλείο γονιδιακής θεραπείας. Οι θεραπείες συχνά συσκευάζονται σε αδενο-σχετιζόμενους ιούς (AAVs), οι οποίοι είναι ως επί το πλείστον αβλαβείς και μπορούν να προσφέρουν θεραπείες στα κύτταρα. Κατά τη δημιουργία των πλασμιδίων για αυτά τα AAV, οι ερευνητές τοποθετούν ένα θεραπευτικό γονίδιο μεταξύ αλληλουχιών που ονομάζονται ITRs, οι οποίες διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη διασφάλιση της συσκευασίας του γονιδίου στον ιό για παράδοση. Αυτές οι αλληλουχίες ουσιαστικά στέλνουν ένα βιολογικό σήμα στα κύτταρα που λέει «ανήκω σε αυτόν τον ιό». Ωστόσο, η ομάδα διαπίστωσε ότι περίπου το 40% των πλασμιδίων AAV στη μελέτη είχαν μεταλλάξεις στις περιοχές ITR που θα μπορούσαν να παραμορφώσουν αυτό το σημαντικό μήνυμα. Εάν οι ερευνητές χρησιμοποιούσαν αυτά τα εσφαλμένα σχεδιασμένα πλασμίδια, η γονιδιακή τους θεραπεία μπορεί να μην λειτουργήσει - και θα μπορούσε να χρειαστεί πολύς χρόνος για να καταλάβουν οι επιστήμονες γιατί.

Ο Mark Kay, ειδικός παιδιατρικής και γενετικής στο Stanford School of Medicine στην Καλιφόρνια, έχει επίσης δει από πρώτο χέρι ότι τα σφάλματα πλασμιδίου μπορεί να καθυστερήσουν τα εργαστηριακά έργα. Ωστόσο, είναι βέβαιος ότι οι επιστήμονες μπορούν να εντοπίσουν και να διορθώσουν αυτά τα λάθη. Λέει ότι οι ερευνητές γονιδιακής θεραπείας γνωρίζουν πιθανά προβλήματα ITR και ότι τα σφάλματα είναι απίθανο σε κλινικές συνθήκες. Αυτό συμβαίνει επειδή ρυθμιστικοί φορείς όπως ο Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ έχουν αυστηρά πρότυπα που απαιτούν από τους ερευνητές να αναλύουν προσεκτικά τα πλασμίδια τους πριν τα χρησιμοποιήσουν στην κλινική.

Ο Nakai λέει ότι ο έλεγχος των πλασμιδίων για σφάλματα μέσω της αλληλουχίας θα μπορούσε να προειδοποιήσει τους ερευνητές για τα προβλήματα που επισημάνθηκαν στη μελέτη. Ορισμένες εταιρείες, συμπεριλαμβανομένων των Plasmidsaurus στο Eugene του Όρεγκον και της Elim Biopharmaceuticals στο Hayward της Καλιφόρνια, προσφέρουν αλληλουχία πλασμιδίου για περίπου 15,00 $ ανά δείγμα, λέει ο Nakai, ο οποίος δεν έχει οικονομικό συμφέρον σε καμία από τις δύο εταιρείες. Συνιστά επίσης στα νέα μέλη του εργαστηρίου να αφιερώνουν χρόνο μαθαίνοντας από έμπειρους σχεδιαστές πλασμιδίων. Είναι μια επίπονη, χειροποίητη διαδικασία, λέει, αλλά αν κάνετε ένα λάθος μπορεί να χάσετε τεράστιο χρόνο και χρήμα.

Ένας άλλος τρόπος για τα εργαστήρια να αποφύγουν προβλήματα είναι να κάνουν τις πλασμιδιακές αλληλουχίες τους διαθέσιμες στο κοινό σε αποθετήρια ανοιχτής πρόσβασης, λέει η Μελίνα Φαν, επικεφαλής επιστημονική υπεύθυνη στο μη κερδοσκοπικό Addgene στο Watertown της Μασαχουσέτης. Το Addgene παρέχει ένα τέτοιο αποθετήριο, λέει ο Fan, και «αναλύει την αλληλουχία των κατατεθειμένων πλασμιδίων και μοιράζεται τα δεδομένα αλληλουχίας μέσω του ιστότοπου για κοινοτική χρήση». Ο έλεγχος των πλασμιδίων είναι σημαντικός, προσθέτει.

Ο Lahn ελπίζει ότι η ανάλυση της ομάδας του στρέφει την προσοχή των ερευνητών στο γεγονός ότι αυτά τα εργαστηριακά εργαλεία θεωρούνται συχνά δεδομένα. «Η υγεία του εργαλείου είναι κάτι που οι άνθρωποι δεν σκέφτονται», λέει, παρόλο που θα έπρεπε.