Los plásmidos diseñados en laboratorio, un caballo de batalla de la biología moderna, tienen problemas. Los investigadores realizaron una evaluación sistemática de las estructuras circulares del ADN analizando más de 2.500 plásmidos elaborados en laboratorios y enviados a una empresa que brinda servicios como empaquetar las estructuras dentro de virus para que puedan usarse como terapias genéticas. El equipo descubrió que casi la mitad de los plásmidos tenían errores de diseño, incluidos errores en secuencias críticas para la expresión de un gen terapéutico. Los investigadores publicaron sus resultados el mes pasado en el servidor de preimpresión bioRxiv. 1.

El estudio expone "una falta de conocimiento" sobre cómo realizar un control de calidad adecuado de los plásmidos en el laboratorio, dice Hiroyuki Nakai, genetista de la Universidad de Ciencias y Salud de Oregón, que no participó en el trabajo. Ya había notado problemas con los plásmidos fabricados en laboratorio, pero le sorprendió la frecuencia de errores descubiertos por el estudio. Es probable que se hayan publicado muchos artículos científicos cuyos resultados no sean reproducibles debido a errores en el diseño del plásmido, añade.

tiempo perdido

Los plásmidos son herramientas populares en los laboratorios de biología, como bacterias, incluido el organismo modelo ampliamente utilizado.Escherichia coli, que utilizan estructuras para almacenar e intercambiar genes. Esto significa que los biólogos pueden crear plásmidos de diseño que contengan varios genes de interés y luegoE. colipersuadirlos para que los registren y hagan muchas copias de ellos.

Bruce Lahn, científico jefe de VectorBuilder, una empresa con sede en Chicago, Illinois, que proporciona herramientas de distribución de genes, dice que él y otros biólogos han notado problemas con la calidad de los plásmidos durante años. Cuando Lahn era profesor en la Universidad de Chicago, un estudiante de posgrado pasó seis meses en su laboratorio reproduciendo dos plásmidos que habían aparecido en la literatura científica. “No pensamos en la calidad de los plásmidos, pero luego el experimento no funcionó” porque los plásmidos contenían errores, afirma.

Ahora en VectorBuilder, Lahn dice que ve el problema todo el tiempo, por lo que decidió evaluarlo sistemáticamente. Cuando los clientes envían plásmidos defectuosos, "pierden mucho tiempo" y los pasos adicionales en el control de calidad aumentan el costo de producir los plásmidos y empaquetarlos en virus, dice.

El análisis del equipo de VectorBuilder reveló una mezcolanza de errores en los más de 2.500 plásmidos evaluados. Algunos contenían genes que codificaban proteínas responsables deE. colieran tóxicos, lo que significa que podían retardar o detener el crecimiento de los organismos en los que confían los biólogos para replicar sus plásmidos. Otros, destinados a empaquetarse en virus, codificaban proteínas que eran tóxicas para esos virus. Y algunos contenían secuencias de ADN repetitivas que pueden acumular mutaciones en los plásmidos.

Comprobando errores

Los errores más comunes que encontraron Lahn y sus colegas estaban asociados con una herramienta clave de terapia genética. Las terapias suelen estar empaquetadas en virus adenoasociados (AAV), que en su mayoría son inofensivos y pueden administrar tratamientos a las células. Al crear los plásmidos para estos AAV, los investigadores intercalan un gen terapéutico entre secuencias llamadas ITR, que desempeñan un papel fundamental a la hora de garantizar que el gen se empaquete en el virus para su administración. Básicamente, estas secuencias envían una señal biológica a las células que dice: "Pertenezco a este virus". Sin embargo, el equipo descubrió que alrededor del 40% de los plásmidos AAV en el estudio tenían mutaciones en las regiones ITR que podrían distorsionar este importante mensaje. Si los investigadores utilizaran estos plásmidos mal diseñados, su terapia genética podría no funcionar, y los científicos podrían tardar mucho en descubrir por qué.

Mark Kay, especialista en pediatría y genética de la Facultad de Medicina de Stanford en California, también ha visto de primera mano que los errores en los plásmidos pueden retrasar los proyectos de laboratorio. Sin embargo, confía en que los científicos puedan identificar y corregir estos errores. Dice que los investigadores de terapia génica son conscientes de los posibles problemas de ITR y que es poco probable que se produzcan errores en entornos clínicos. Esto se debe a que las agencias reguladoras como la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. tienen estándares estrictos que requieren que los investigadores analicen cuidadosamente sus plásmidos antes de usarlos en la clínica.

Nakai dice que comprobar los plásmidos en busca de errores mediante la secuenciación podría alertar a los investigadores sobre los problemas destacados en el estudio. Algunas empresas, incluidas Plasmidsaurus en Eugene, Oregón, y Elim Biopharmaceuticals en Hayward, California, ofrecen secuenciación de plásmidos por alrededor de 15 dólares por muestra, dice Nakai, que no tiene ningún interés financiero en ninguna de las empresas. También recomienda que los nuevos miembros del laboratorio dediquen tiempo a aprender de diseñadores de plásmidos experimentados; Es un proceso laborioso y artesanal, afirma, pero si se comete un error se puede perder una enorme cantidad de tiempo y dinero.

Otra forma que tienen los laboratorios de evitar problemas es hacer que sus secuencias de plásmidos estén disponibles públicamente en repositorios de acceso abierto, dice Melina Fan, directora científica de la organización sin fines de lucro Addgene en Watertown, Massachusetts. Addgene proporciona dicho repositorio, dice Fan, y "secuencia los plásmidos depositados y comparte los datos de la secuencia a través del sitio web para uso de la comunidad". Es importante comprobar los plásmidos, añade.

Lahn espera que el análisis de su equipo llame la atención de los investigadores sobre el hecho de que estas herramientas de laboratorio a menudo se dan por sentado. "La salud de la herramienta es algo en lo que la gente no piensa", afirma, aunque deberían hacerlo.