Laboratoorselt konstrueeritud plasmiididel, mis on kaasaegse bioloogia tööhobune, on probleeme. Teadlased hindasid süstemaatiliselt tsirkulaarseid DNA struktuure, analüüsides enam kui 2500 laborites valmistatud plasmiidi, mis saadeti ettevõttele, mis pakub selliseid teenuseid nagu viiruste struktuuride pakkimine, et neid saaks kasutada geeniteraapiana. Meeskond leidis, et peaaegu pooltel plasmiididel oli disainivigu, sealhulgas vigu terapeutilise geeni ekspressiooni jaoks kriitilistes järjestustes. Teadlased avaldasid oma tulemused eelmisel kuul eeltrükiserveris bioRxiv 1.

Uuring paljastab "teadmiste puudumise" plasmiidide nõuetekohase kvaliteedikontrolli läbiviimise kohta laboris, ütleb Hiroyuki Nakai, Oregoni Tervise- ja Teadusülikooli geneetik, kes ei osalenud töös. Ta oli juba märganud probleeme laboris valmistatud plasmiididega, kuid oli üllatunud uuringu käigus avastatud vigade sagedusest. Tõenäoliselt on avaldatud palju teadustöid, mille tulemused ei ole plasmiidide disaini vigade tõttu reprodutseeritavad, lisab ta.

Raisatud aeg

Plasmiidid on bioloogialaborites populaarsed tööriistad, nagu bakterid, sealhulgas laialdaselt kasutatavad mudelorganismidEscherichia coli, mis kasutavad geenide salvestamiseks ja vahetamiseks struktuure. See tähendab, et bioloogid saavad luua disainerplasmiide, mis sisaldavad erinevaid huvipakkuvaid geene, ja seejärelE. coliveenda neid neid salvestama ja neist palju koopiaid tegema.

Chicagos Illinoisi osariigis asuva geenide kohaletoimetamise tööriistu pakkuva ettevõtte VectorBuilder juhtivteadlane Bruce Lahn ütleb, et tema ja teised bioloogid on aastaid märganud probleeme plasmiidide kvaliteediga. Kui Lahn oli Chicago ülikooli professor, kulutas tema labori kraadiõppur kuus kuud, et reprodutseerida kahte plasmiidi, millest oli teatatud teaduskirjanduses. "Me ei mõelnud plasmiidide kvaliteedile, kuid siis katse ei töötanud", sest plasmiidid sisaldasid vigu, ütleb ta.

Nüüd, VectorBuilderis, ütleb Lahn, et näeb probleemi kogu aeg – seega otsustas ta seda süstemaatiliselt hinnata. Kui kliendid esitavad vigased plasmiidid, "raiskavad nad palju aega" ja kvaliteedikontrolli lisaetapid suurendavad plasmiidide tootmise ja viirustesse pakendamise kulusid, ütleb ta.

VectorBuilderi meeskonna analüüs näitas, et enam kui 2500 hinnatud plasmiidis on vigu. Mõned sisaldasid geene, mis kodeerisid valke, mis vastutavadE. coliolid mürgised, mis tähendab, et nad võisid aeglustada või peatada nende organismide kasvu, millele bioloogid oma plasmiidide paljunemisel tuginevad. Teised, mis olid mõeldud viirustesse pakkimiseks, kodeerisid valke, mis olid nendele viirustele mürgised. Ja mõned sisaldasid korduvaid DNA järjestusi, mis võivad plasmiidides mutatsioone koguda.

Vigade kontrollimine

Kõige levinumad vead, mille Lahn ja tema kolleegid leidsid, olid seotud peamise geeniteraapia tööriistaga. Ravid on sageli pakendatud adeno-assotsieerunud viirustesse (AAV), mis on enamasti kahjutud ja võivad rakkudele ravi anda. Nende AAV-de plasmiidide loomisel lisavad teadlased terapeutilise geeni järjestuste, mida nimetatakse ITR-deks, vahele, mis mängivad olulist rolli geeni pakendamise tagamisel viirusesse kohaletoimetamiseks. Need järjestused saadavad rakkudele sisuliselt bioloogilise signaali, mis ütleb: "Ma kuulun sellesse viirusesse". Töörühm leidis aga, et ligikaudu 40% uuringus osalenud AAV plasmiididest olid ITR piirkondades mutatsioonid, mis võivad seda olulist sõnumit moonutada. Kui teadlased kasutaksid neid valesti kavandatud plasmiide, ei pruugi nende geeniteraapia toimida - ja teadlastel võib kuluda palju aega, enne kui nad aru saavad, miks.

California Stanfordi meditsiinikooli pediaatria ja geneetika spetsialist Mark Kay on samuti näinud, et plasmiidivead võivad laboriprojekte edasi lükata. Siiski on ta kindel, et teadlased suudavad need vead tuvastada ja parandada. Ta ütleb, et geeniteraapia teadlased on teadlikud võimalikest ITR-probleemidest ja et vead on kliinilistes tingimustes ebatõenäolised. Selle põhjuseks on asjaolu, et reguleerivatel asutustel, nagu USA Toidu- ja Ravimiamet, on ranged standardid, mis nõuavad teadlastelt oma plasmiide ​​enne nende kliinikus kasutamist hoolikalt analüüsida.

Nakai ütleb, et plasmiidide vigade kontrollimine sekveneerimise abil võib teadlasi hoiatada uuringus esile tõstetud probleemide eest. Mõned ettevõtted, sealhulgas Plasmidsaurus Eugene'is Oregonis ja Elim Biopharmaceuticals Californias Haywardis, pakuvad plasmiidide sekveneerimist umbes 15,00 dollari eest proovi kohta, ütleb Nakai, kellel pole kummagi ettevõtte vastu rahalist huvi. Samuti soovitab ta uutel laboriliikmetel kulutada aega kogenud plasmiidide kujundajatelt õppimisele; Ta ütleb, et see on vaevarikas ja käsitsi valmistatud protsess, kuid kui teete vea, võib see raisata tohutult aega ja raha.

Veel üks võimalus laboritele probleemide vältimiseks on teha oma plasmiidijärjestused avalikult kättesaadavaks avatud juurdepääsuga hoidlates, ütleb Massachusettsi osariigis Watertownis asuva mittetulundusühingu Addgene teadusjuht Melina Fan. Addgene pakub sellist hoidlat, ütleb Fan, ja see "sekveneerib deponeeritud plasmiidid ja jagab järjestuse andmeid veebisaidi kaudu kogukonna kasutamiseks." Plasmiidide kontrollimine on oluline, lisab ta.

Lahn loodab, et tema meeskonna analüüs juhib teadlaste tähelepanu asjaolule, et neid tööhobuste laboritööriistu peetakse sageli iseenesestmõistetavaks. "Tööriista tervisele inimesed ei mõtle," ütleb ta, kuigi peaks.