Laboratoriossa suunnitelluilla plasmideilla, modernin biologian työhevosilla, on ongelmia. Tutkijat suorittivat systemaattisen arvion pyöreistä DNA-rakenteista analysoimalla yli 2 500 plasmidia, jotka tehtiin laboratorioissa ja lähetettiin yritykselle, joka tarjoaa palveluita, kuten pakkaamalla rakenteet viruksiin, jotta niitä voidaan käyttää geeniterapiana. Ryhmä havaitsi, että lähes puolella plasmideista oli suunnitteluvirheitä, mukaan lukien virheet terapeuttisen geenin ilmentymisen kannalta kriittisissä sekvensseissä. Tutkijat julkaisivat tulokset viime kuussa preprint-palvelimella bioRxiv 1.

Tutkimus paljastaa "tiedon puutteen" plasmidien asianmukaisesta laadunvalvonnasta laboratoriossa, sanoo Hiroyuki Nakai, geneetikko Oregonin Health & Science -yliopistosta, joka ei osallistunut työhön. Hän oli jo huomannut ongelmia laboratoriovalmisteiden plasmideissa, mutta oli yllättynyt tutkimuksen paljastamien virheiden esiintymistiheydestä. Todennäköisesti on julkaistu monia tieteellisiä julkaisuja, joiden tulokset eivät ole toistettavissa plasmidisuunnittelun virheiden vuoksi, hän lisää.

Hukkaan mennyt aika

Plasmidit ovat suosittuja työkaluja biologian laboratorioissa bakteereina, mukaan lukien laajalti käytetty malliorganismiEscherichia coli, jotka käyttävät rakenteita geenien tallentamiseen ja vaihtamiseen. Tämä tarkoittaa, että biologit voivat luoda suunnittelijaplasmideja, jotka sisältävät erilaisia ​​kiinnostavia geenejä, ja sittenE. colisaada heidät tallentamaan nämä ja tekemään niistä monia kopioita.

Bruce Lahn, Chicagossa, Illinoisissa sijaitsevan geeninsiirtotyökaluja tarjoavan VectorBuilderin päätutkija, sanoo, että hän ja muut biologit ovat havainneet ongelmia plasmidin laadussa vuosien ajan. Kun Lahn oli professori Chicagon yliopistossa, hänen laboratorionsa jatko-opiskelija vietti kuusi kuukautta toistaen kahta plasmidia, joista oli raportoitu tieteellisessä kirjallisuudessa. "Emme ajatellut plasmidien laatua, mutta sitten koe ei toiminut", koska plasmidit sisälsivät virheitä, hän sanoo.

Nyt VectorBuilderissa Lahn sanoo näkevänsä ongelman koko ajan - joten hän päätti arvioida sitä järjestelmällisesti. Kun asiakkaat lähettävät viallisia plasmideja, "he hukkaavat paljon aikaa", ja ylimääräiset laadunvalvonnan vaiheet lisäävät plasmidien tuotannon ja viruksiksi pakkaamisen kustannuksia, hän sanoo.

VectorBuilder-tiimin analyysi paljasti yli 2 500 arvioidussa plasmidissa virheitä. Jotkut sisälsivät geenejä, jotka koodasivat proteiinejaE. coliolivat myrkyllisiä, mikä tarkoittaa, että ne saattoivat hidastaa tai pysäyttää niiden organismien kasvun, joihin biologit luottavat plasmidien replikoinnissa. Toiset, jotka oli tarkoitettu pakattavaksi viruksiin, koodasivat proteiineja, jotka olivat myrkyllisiä näille viruksille. Ja jotkut sisälsivät toistuvia DNA-sekvenssejä, jotka voivat kerääntyä mutaatioita plasmideihin.

Tarkistetaan virheitä

Yleisimmät Lahnin ja hänen kollegoidensa löytämät virheet liittyivät keskeiseen geeniterapiatyökaluun. Hoidot pakataan usein adeno-assosioituneisiin viruksiin (AAV), jotka ovat enimmäkseen vaarattomia ja voivat toimittaa hoitoja soluihin. Kun tutkijat luovat plasmideja näille AAV:ille, tutkijat asettavat terapeuttisen geenin ITR:iksi kutsuttujen sekvenssien väliin, joilla on kriittinen rooli sen varmistamisessa, että geeni pakataan virukseen toimittamista varten. Nämä sekvenssit lähettävät soluille biologisen signaalin, joka sanoo "kuulun tähän virukseen". Ryhmä kuitenkin havaitsi, että noin 40 %:lla tutkimuksen AAV-plasmideista oli mutaatioita ITR-alueilla, jotka saattoivat vääristää tätä tärkeää viestiä. Jos tutkijat käyttäisivät näitä väärin suunniteltuja plasmideja, niiden geeniterapia ei ehkä toimi – ja voi kestää kauan ennen kuin tiedemiehet keksivät miksi.

Mark Kay, Kalifornian Stanford School of Medicine -koulun pediatrian ja genetiikan asiantuntija, on myös nähnyt omakohtaisesti, että plasmidivirheet voivat viivyttää laboratorioprojekteja. Hän on kuitenkin varma, että tutkijat voivat tunnistaa ja korjata nämä virheet. Hän sanoo, että geeniterapian tutkijat ovat tietoisia mahdollisista ITR-ongelmista ja että virheet ovat epätodennäköisiä kliinisissä olosuhteissa. Tämä johtuu siitä, että sääntelyviranomaisilla, kuten Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirastolla, on tiukat standardit, jotka vaativat tutkijoita analysoimaan huolellisesti plasmidinsa ennen niiden käyttöä klinikalla.

Nakai sanoo, että plasmidien virheiden tarkistaminen sekvensoinnin avulla voisi varoittaa tutkijoita tutkimuksessa esiin tuoduista ongelmista. Jotkut yritykset, mukaan lukien Plasmidsaurus Eugenessa, Oregonissa ja Elim Biopharmaceuticals Haywardissa, Kaliforniassa, tarjoavat plasmidisekvensointia noin 15,00 dollarilla näytettä kohti, sanoo Nakai, jolla ei ole taloudellista intressiä kummassakaan yrityksessä. Hän suosittelee myös, että uudet laboratorion jäsenet viettävät aikaa kokeneiden plasmidisuunnittelijoiden oppimiseen; Se on työläs, käsin tehty prosessi, hän sanoo, mutta jos teet virheen, se voi hukata valtavasti aikaa ja rahaa.

Toinen tapa laboratorioille välttää ongelmia on saattaa plasmidisekvenssinsä julkisesti saataville avoimissa arkistoissa, sanoo Melina Fan, voittoa tavoittelemattoman Addgenen johtaja Watertownissa, Massachusettsissa. Addgene tarjoaa tällaisen arkiston, Fan sanoo, ja se "sekvensoi talletetut plasmidit ja jakaa sekvenssitiedot verkkosivuston kautta yhteisön käyttöön". Plasmidien tarkistaminen on tärkeää, hän lisää.

Lahn toivoo, että hänen tiiminsä analyysi kiinnittää tutkijoiden huomion siihen, että näitä työhevoslaboratoriotyökaluja pidetään usein itsestäänselvyytenä. "Työkalun terveys on asia, jota ihmiset eivät ajattele", hän sanoo, vaikka pitäisi.