Les plasmides fabriqués en laboratoire, un cheval de bataille de la biologie moderne, ont des problèmes. Les chercheurs ont procédé à une évaluation systématique des structures circulaires de l'ADN en analysant plus de 2 500 plasmides fabriqués en laboratoire et envoyés à une entreprise qui fournit des services tels que le conditionnement des structures dans des virus afin qu'elles puissent être utilisées comme thérapies géniques. L’équipe a découvert que près de la moitié des plasmides présentaient des erreurs de conception, notamment des erreurs dans les séquences essentielles à l’expression d’un gène thérapeutique. Les chercheurs ont publié leurs résultats le mois dernier sur le serveur de prépublication bioRxiv 1.

L'étude révèle "un manque de connaissances" sur la manière d'effectuer un contrôle qualité approprié des plasmides en laboratoire, explique Hiroyuki Nakai, généticien à l'Université de la Santé et des Sciences de l'Oregon, qui n'a pas participé aux travaux. Il avait déjà remarqué des problèmes avec les plasmides fabriqués en laboratoire, mais il a été surpris par la fréquence des erreurs découvertes par l'étude. Il existe probablement de nombreux articles scientifiques publiés dont les résultats ne sont pas reproductibles en raison d'erreurs dans la conception du plasmide, ajoute-t-il.

Temps perdu

Les plasmides sont des outils populaires dans les laboratoires de biologie, tout comme les bactéries, y compris l'organisme modèle largement utilisé.Escherichia coli, qui utilisent des structures pour stocker et échanger des gènes. Cela signifie que les biologistes peuvent créer des plasmides de conception contenant divers gènes d'intérêt, puisE. colipersuadez-les de les enregistrer et d’en faire de nombreuses copies.

Bruce Lahn, scientifique en chef chez VectorBuilder, une société basée à Chicago, dans l'Illinois, qui fournit des outils de transmission de gènes, affirme que lui et d'autres biologistes ont remarqué des problèmes de qualité des plasmides depuis des années. Lorsque Lahn était professeur à l'Université de Chicago, un étudiant diplômé de son laboratoire a passé six mois à reproduire deux plasmides rapportés dans la littérature scientifique. « Nous n'avons pas réfléchi à la qualité des plasmides, mais l'expérience n'a pas fonctionné » car les plasmides contenaient des erreurs, dit-il.

Désormais chez VectorBuilder, Lahn dit qu'il voit le problème tout le temps. Il a donc décidé de l'évaluer systématiquement. Lorsque les clients soumettent des plasmides défectueux, « ils perdent beaucoup de temps » et les étapes supplémentaires de contrôle qualité augmentent le coût de production des plasmides et de leur conditionnement en virus, dit-il.

L'analyse de l'équipe VectorBuilder a révélé un mélange d'erreurs dans plus de 2 500 plasmides évalués. Certains contenaient des gènes codant pour des protéines responsables deE. coliétaient toxiques, ce qui signifie qu’ils pourraient ralentir ou arrêter la croissance des organismes sur lesquels les biologistes comptent pour répliquer leurs plasmides. D’autres, destinés à être emballés dans des virus, codaient pour des protéines toxiques pour ces virus. Et certains contenaient des séquences d’ADN répétitives pouvant accumuler des mutations dans les plasmides.

Vérification des erreurs

Les erreurs les plus courantes découvertes par Lahn et ses collègues étaient associées à un outil clé de thérapie génique. Les thérapies sont souvent conditionnées dans des virus adéno-associés (AAV), qui sont pour la plupart inoffensifs et peuvent administrer des traitements aux cellules. Lors de la création des plasmides pour ces AAV, les chercheurs prennent en sandwich un gène thérapeutique entre des séquences appelées ITR, qui jouent un rôle essentiel en garantissant que le gène est emballé dans le virus pour être délivré. Ces séquences envoient essentiellement un signal biologique aux cellules indiquant « J’appartiens à ce virus ». Cependant, l’équipe a découvert qu’environ 40 % des plasmides AAV de l’étude présentaient des mutations dans les régions ITR qui pourraient fausser ce message important. Si les chercheurs utilisaient ces plasmides mal conçus, leur thérapie génique pourrait ne pas fonctionner – et les scientifiques pourraient mettre beaucoup de temps à comprendre pourquoi.

Mark Kay, spécialiste en pédiatrie et en génétique à la Stanford School of Medicine en Californie, a également constaté que les erreurs plasmidiques peuvent retarder les projets de laboratoire. Il est toutefois convaincu que les scientifiques pourront identifier et corriger ces erreurs. Il affirme que les chercheurs en thérapie génique sont conscients des problèmes possibles d'ITR et que les erreurs sont peu probables en milieu clinique. En effet, les agences de réglementation telles que la Food and Drug Administration des États-Unis ont des normes strictes qui exigent que les chercheurs analysent soigneusement leurs plasmides avant de les utiliser en clinique.

Nakai affirme que la recherche d'erreurs dans les plasmides grâce au séquençage pourrait alerter les chercheurs sur les problèmes mis en évidence dans l'étude. Certaines sociétés, notamment Plasmidsaurus à Eugene, Oregon, et Elim Biopharmaceuticals à Hayward, Californie, proposent le séquençage de plasmides pour environ 15,00 $ par échantillon, explique Nakai, qui n'a aucun intérêt financier dans l'une ou l'autre société. Il recommande également aux nouveaux membres du laboratoire de passer du temps à apprendre auprès de concepteurs de plasmides expérimentés ; Il s'agit d'un processus laborieux et artisanal, dit-il, mais si vous faites une erreur, cela peut vous faire perdre énormément de temps et d'argent.

Une autre façon pour les laboratoires d'éviter les problèmes est de rendre leurs séquences plasmidiques accessibles au public dans des référentiels en libre accès, explique Melina Fan, directrice scientifique de l'association à but non lucratif Addgene à Watertown, Massachusetts. Addgene fournit un tel référentiel, explique Fan, et il « séquence les plasmides déposés et partage les données de séquence via le site Web pour une utilisation communautaire ». Vérifier les plasmides est important, ajoute-t-elle.

Lahn espère que l'analyse de son équipe attirera l'attention des chercheurs sur le fait que ces outils de laboratoire performants sont souvent tenus pour acquis. « La santé de l’outil est une chose à laquelle les gens ne pensent pas », dit-il, même s’ils devraient le faire.