Laboratorijski proizvedeni plazmidi, radni konj moderne biologije, imaju problema. Istraživači su proveli sustavnu procjenu kružnih struktura DNK analizom više od 2500 plazmida napravljenih u laboratorijima i poslanih tvrtki koja pruža usluge kao što je pakiranje struktura unutar virusa kako bi se mogli koristiti kao genske terapije. Tim je otkrio da je gotovo polovica plazmida imala pogreške u dizajnu, uključujući pogreške u sekvencama kritičnim za ekspresiju terapeutskog gena. Istraživači su svoje rezultate objavili prošlog mjeseca na poslužitelju za preprint bioRxiv 1.

Studija razotkriva "nedostatak znanja" o provođenju odgovarajuće kontrole kvalitete plazmida u laboratoriju, kaže Hiroyuki Nakai, genetičar sa Sveučilišta Health & Science u Oregonu koji nije bio uključen u rad. Već je primijetio probleme s laboratorijski proizvedenim plazmidima, ali ga je iznenadila učestalost pogrešaka koje je otkrila studija. Vjerojatno postoji mnogo znanstvenih radova koji su objavljeni za koje se rezultati ne mogu ponoviti zbog pogrešaka u dizajnu plazmida, dodaje.

Potrošeno vrijeme

Plazmidi su popularni alati u biološkim laboratorijima, kao bakterije, uključujući široko korišten model organizmaEscherichia coli, koji koriste strukture za pohranu i razmjenu gena. To znači da biolozi mogu stvoriti dizajnerske plazmide koji sadrže različite gene od interesa, a zatimE.coliuvjerite ih da ih snime i naprave mnogo kopija.

Bruce Lahn, glavni znanstvenik u VectorBuilderu, tvrtki sa sjedištem u Chicagu, Illinois, koja pruža alate za dostavu gena, kaže da su on i drugi biolozi godinama primjećivali probleme s kvalitetom plazmida. Dok je Lahn bio profesor na Sveučilištu u Chicagu, jedan diplomirani student u njegovom je laboratoriju proveo šest mjeseci reproducirajući dva plazmida o kojima je izvještačeno u znanstvenoj literaturi. “Nismo razmišljali o kvaliteti plazmida, ali tada eksperiment nije uspio” jer su plazmidi sadržavali pogreške, kaže.

Sada u VectorBuilderu, Lahn kaže da stalno vidi problem - pa ga je odlučio sustavno procijeniti. Kad kupci predaju neispravne plazmide, "gube puno vremena", a dodatni koraci u kontroli kvalitete povećavaju troškove proizvodnje plazmida i njihovog pakiranja u viruse, kaže on.

Analiza tima VectorBuildera otkrila je gomilu pogrešaka u više od 2500 procijenjenih plazmida. Neki su sadržavali gene koji su kodirali proteine ​​odgovorne zaE.colibili su toksični, što znači da bi mogli usporiti ili zaustaviti rast organizama na koje se biolozi oslanjaju da repliciraju svoje plazmide. Drugi, namijenjeni za pakiranje u viruse, kodirali su proteine ​​koji su bili otrovni za te viruse. A neki su sadržavali ponavljajuće sekvence DNK koje mogu akumulirati mutacije u plazmidima.

Provjera grešaka

Najčešće pogreške koje su Lahn i njegovi kolege pronašli bile su povezane s ključnim alatom za gensku terapiju. Terapije su često upakirane u adeno-povezane viruse (AAV), koji su uglavnom bezopasni i mogu isporučiti tretmane stanicama. Kada stvaraju plazmide za ove AAV-ove, istraživači stavljaju terapeutski gen između sekvenci koje se nazivaju ITR-ovi, a koje igraju ključnu ulogu u osiguravanju pakiranja gena u virus za isporuku. Ove sekvence u biti šalju biološki signal stanicama koji kaže "ja pripadam ovom virusu". Međutim, tim je otkrio da je oko 40% AAV plazmida u studiji imalo mutacije u ITR regijama koje bi mogle iskriviti ovu važnu poruku. Kad bi istraživači koristili te krivo dizajnirane plazmide, njihova genska terapija možda ne bi djelovala - a znanstvenicima bi moglo trebati dosta vremena da shvate zašto.

Mark Kay, specijalist pedijatrije i genetike na Medicinskom fakultetu Stanford u Kaliforniji, također se iz prve ruke uvjerio da greške u plazmidu mogu odgoditi laboratorijske projekte. Međutim, uvjeren je da znanstvenici mogu identificirati i ispraviti te pogreške. Kaže da su istraživači genske terapije svjesni mogućih problema s ITR-om i da su pogreške malo vjerojatne u kliničkim uvjetima. To je zato što regulatorne agencije poput američke Agencije za hranu i lijekove imaju stroge standarde koji zahtijevaju od istraživača da pažljivo analiziraju svoje plazmide prije upotrebe u klinici.

Nakai kaže da bi provjera grešaka u plazmidima putem sekvenciranja mogla upozoriti istraživače na probleme istaknute u studiji. Neke tvrtke, uključujući Plasmidsaurus u Eugeneu, Oregon, i Elim Biopharmaceuticals u Haywardu, Kalifornija, nude sekvenciranje plazmida za oko 15,00 dolara po uzorku, kaže Nakai, koji nema financijski interes ni u jednoj tvrtki. On također preporučuje da novi članovi laboratorija provedu vrijeme učeći od iskusnih dizajnera plazmida; To je naporan, ručno izrađen proces, kaže on, ali ako pogriješite, možete izgubiti ogromnu količinu vremena i novca.

Još jedan način da laboratoriji izbjegnu probleme jest da svoje sekvence plazmida učine javno dostupnima u spremištima s otvorenim pristupom, kaže Melina Fan, glavna znanstvena službenica u neprofitnoj organizaciji Addgene u Watertownu, Massachusetts. Addgene pruža takvo spremište, kaže Fan, i ono "sekvencira pohranjene plazmide i dijeli podatke o sekvencama putem web stranice za korištenje zajednice." Provjera plazmida je važna, dodaje ona.

Lahn se nada da će analiza njegovog tima privući pozornost istraživača na činjenicu da se ovi laboratorijski alati često uzimaju zdravo za gotovo. "Zdravlje alata nešto je o čemu ljudi ne razmišljaju", kaže on, iako bi trebali.