A laboratóriumilag tervezett plazmidok, a modern biológia igáslovai, problémákkal küzdenek. A kutatók a körkörös DNS-struktúrák szisztematikus felmérését végezték el több mint 2500 laboratóriumban készített plazmid elemzésével, amelyeket egy olyan cégnek küldtek el, amely olyan szolgáltatásokat nyújt, mint például a vírusokba csomagoló szerkezetek génterápiaként való felhasználása. A csapat azt találta, hogy a plazmidok csaknem fele tervezési hibákat tartalmazott, beleértve a terápiás gén expressziója szempontjából kritikus szekvenciák hibáit. A kutatók a múlt hónapban publikálták eredményeiket a bioRxiv nyomtatás előtti szerveren 1.

Hiroyuki Nakai, az oregoni Health & Science University genetikusa, aki nem vett részt a munkában, a tanulmány felfedi a plazmidok megfelelő minőség-ellenőrzésének laboratóriumi elvégzésével kapcsolatos ismeretek hiányát. Már korábban is észlelt problémákat a laboratóriumi plazmidokkal kapcsolatban, de meglepte a vizsgálat során feltárt hibák gyakorisága. Valószínűleg sok olyan tudományos közleményt publikáltak, amelyek eredményei a plazmidtervezési hibák miatt nem reprodukálhatók – teszi hozzá.

Elpazarolt idő

A plazmidok népszerű eszközök a biológiai laboratóriumokban, mint baktériumok, beleértve a széles körben használt modellszervezeteket isEscherichia coli, amelyek struktúrákat használnak a gének tárolására és cseréjére. Ez azt jelenti, hogy a biológusok tervező plazmidokat hozhatnak létre, amelyek különféle érdekes géneket tartalmaznak, majdE. colirávenni őket, hogy ezeket rögzítsék, és sok másolatot készítsenek róluk.

Bruce Lahn, a VectorBuilder, egy chicagói, illinoisi székhelyű, génbejuttató eszközöket kínáló vállalat vezető tudósa azt mondja, hogy ő és más biológusok évek óta észlelték a plazmidminőséggel kapcsolatos problémákat. Amikor Lahn a Chicagói Egyetem professzora volt, egy végzős hallgató a laboratóriumában hat hónapot töltött azzal, hogy két olyan plazmidot reprodukáljon, amelyekről a tudományos irodalomban beszámoltak. „Nem gondoltunk a plazmidok minőségére, de aztán a kísérlet nem működött”, mert a plazmidok hibákat tartalmaztak – mondja.

Most a VectorBuildernél Lahn azt mondja, hogy mindig látja a problémát – ezért úgy döntött, hogy szisztematikusan értékeli azt. Amikor az ügyfelek hibás plazmidokat küldenek be, "sok időt veszítenek el", és a minőség-ellenőrzés extra lépései megnövelik a plazmidok előállításának és vírusokba való csomagolásának költségeit, mondja.

A VectorBuilder csapat elemzése hibák halmazát tárta fel a több mint 2500 értékelt plazmidban. Néhányan olyan géneket tartalmaztak, amelyek a felelős fehérjéket kódoltákE. colimérgezőek voltak, ami azt jelenti, hogy lelassíthatják vagy leállíthatják azoknak az organizmusoknak a növekedését, amelyekre a biológusok támaszkodnak plazmidjaik replikációjában. Mások, amelyeket vírusokba csomagoltak, olyan fehérjéket kódoltak, amelyek mérgezőek voltak ezekre a vírusokra. Néhányan pedig ismétlődő DNS-szekvenciákat tartalmaztak, amelyek mutációkat halmozhatnak fel a plazmidokban.

Hibák ellenőrzése

A leggyakoribb hibák, amelyeket Lahn és munkatársai találtak, egy kulcsfontosságú génterápiás eszközhöz kapcsolódnak. A terápiákat gyakran adeno-asszociált vírusokba (AAV-k) csomagolják, amelyek többnyire ártalmatlanok, és kezelést tudnak eljuttatni a sejtekhez. Az AAV-k plazmidjainak létrehozásakor a kutatók egy terápiás gént helyeznek el az ITR-nek nevezett szekvenciák közé, amelyek kritikus szerepet játszanak abban, hogy a gént a vírusba csomagolják szállítás céljából. Ezek a szekvenciák lényegében biológiai jelet küldenek a sejteknek, amely azt mondja: „Ebbe a vírusba tartozom”. A csapat azonban azt találta, hogy a vizsgálatban szereplő AAV-plazmidok körülbelül 40%-a tartalmazott mutációkat az ITR régiókban, amelyek eltorzíthatják ezt a fontos üzenetet. Ha a kutatók ezeket a rosszul megtervezett plazmidokat használnák, előfordulhat, hogy a génterápiájuk nem működne – és sok időbe telhet, amíg a tudósok rájönnek, miért.

Mark Kay, a kaliforniai Stanford School of Medicine gyermekgyógyászati ​​és genetikai szakembere szintén saját bőrén tapasztalta, hogy a plazmidhibák késleltethetik a laboratóriumi projekteket. Abban azonban bízik, hogy a tudósok azonosítani és kijavítani tudják ezeket a hibákat. Azt mondja, hogy a génterápiás kutatók tisztában vannak a lehetséges ITR-problémákkal, és azzal, hogy a hibák klinikai körülmények között nem valószínűek. Ennek az az oka, hogy a szabályozó ügynökségek, például az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága szigorú szabványokat ír elő, amelyek megkövetelik a kutatókat, hogy gondosan elemezzék plazmidjaikat, mielőtt a klinikán felhasználnák azokat.

Nakai szerint a plazmidok hibakeresése szekvenálás segítségével figyelmeztetheti a kutatókat a tanulmányban kiemelt problémákra. Egyes vállalatok, köztük az oregoni Eugene-ben található Plasmidsaurus és a kaliforniai Haywardban található Elim Biopharmaceuticals, mintánként körülbelül 15,00 dollárért kínálnak plazmidszekvenálást, mondja Nakai, akinek egyik cégben sem fűződik pénzügyi érdekeltsége. Azt is javasolja, hogy az új labortagok tanuljanak a tapasztalt plazmidtervezőktől; Ez egy fáradságos, kézzel készített folyamat, mondja, de ha hibázik, az rengeteg időt és pénzt pazarolhat el.

A laborok egy másik módja annak, hogy elkerüljék a problémákat, ha plazmidszekvenciáikat nyilvánosan elérhetővé teszik a nyílt hozzáférésű tárolókban, mondja Melina Fan, a Massachusetts állambeli Watertown-i Addgene nonprofit tudományos igazgatója. Az Addgene egy ilyen adattárat biztosít, mondja Fan, és „szekvenálja a letétbe helyezett plazmidokat, és megosztja a szekvenciaadatokat a weboldalon keresztül közösségi használatra”. A plazmidok ellenőrzése fontos, teszi hozzá.

Lahn reméli, hogy csapata elemzése felhívja a kutatók figyelmét arra, hogy ezeket az igásló laboratóriumi eszközöket gyakran természetesnek tekintik. „Az eszköz egészségére az emberek nem gondolnak” – mondja, pedig kellene.