Laboratoriškai sukurtos plazmidės, šiuolaikinės biologijos arkliukas, turi problemų. Tyrėjai atliko sisteminį žiedinių DNR struktūrų vertinimą, analizuodami daugiau nei 2500 plazmidžių, pagamintų laboratorijose ir išsiųstų įmonei, kuri teikia tokias paslaugas kaip struktūrų pakavimas virusuose, kad jas būtų galima naudoti kaip genų terapiją. Komanda nustatė, kad beveik pusė plazmidžių turėjo projektavimo klaidų, įskaitant terapinio geno ekspresijai svarbių sekų klaidas. Praėjusį mėnesį mokslininkai paskelbė savo rezultatus išankstinio spausdinimo serveryje bioRxiv 1.

Tyrimas atskleidžia „žinių trūkumą“ apie tinkamą plazmidžių kokybės kontrolę laboratorijoje, sako Hiroyuki Nakai, Oregono sveikatos ir mokslo universiteto genetikas, kuris nedalyvavo darbe. Jis jau buvo pastebėjęs problemų, susijusių su laboratorijoje pagamintomis plazmidėmis, tačiau jį nustebino tyrimo metu atskleistų klaidų dažnis. Tikėtina, kad buvo paskelbta daug mokslinių straipsnių, kurių rezultatai neatkuriami dėl plazmidės projektavimo klaidų, priduria jis.

Sugaištas laikas

Plazmidės yra populiarios priemonės biologijos laboratorijose, kaip bakterijos, įskaitant plačiai naudojamus modelio organizmusEscherichia coli, kurios naudoja struktūras genams saugoti ir keistis. Tai reiškia, kad biologai gali sukurti dizainerių plazmides, kuriose yra įvairių dominančių genų, ir tadaE.coliįtikinti juos įrašyti juos ir padaryti daug jų kopijų.

Bruce'as Lahnas, Čikagoje, Ilinojaus valstijoje įsikūrusios bendrovės „VectorBuilder“, kuri teikia genų pristatymo įrankius, vyriausiasis mokslininkas sako, kad jis ir kiti biologai daugelį metų pastebėjo plazmidės kokybės problemų. Kai Lahnas buvo Čikagos universiteto profesorius, jo laboratorijos absolventas šešis mėnesius atgamino dvi plazmides, apie kurias buvo pranešta mokslinėje literatūroje. „Mes negalvojome apie plazmidžių kokybę, bet tada eksperimentas nepasiteisino“, nes plazmidėse buvo klaidų, sako jis.

Dabar „VectorBuilder“ Lahnas teigia, kad problemą mato visą laiką, todėl nusprendė sistemingai ją įvertinti. Kai klientai pateikia klaidingas plazmides, „jie sugaišta daug laiko“, o papildomi kokybės kontrolės veiksmai padidina plazmidžių gamybos ir pakavimo į virusus išlaidas, sako jis.

„VectorBuilder“ komandos analizė atskleidė klaidų krūvą daugiau nei 2500 įvertintų plazmidžių. Kai kuriuose buvo genų, koduojančių baltymus, atsakingus užE.colibuvo toksiški, o tai reiškia, kad jie galėjo sulėtinti arba sustabdyti organizmų, kuriais biologai remiasi replikuodami savo plazmides, augimą. Kiti, skirti pakuoti į virusus, užkodavo baltymus, kurie buvo toksiški tiems virusams. O kai kuriose buvo pasikartojančių DNR sekų, kurios gali kaupti mutacijas plazmidėse.

Tikrinamos klaidos

Dažniausiai pasitaikančios klaidos, kurias nustatė Lahnas ir jo kolegos, buvo susijusios su pagrindine genų terapijos priemone. Terapija dažnai yra supakuota į adeno susijusius virusus (AAV), kurie dažniausiai yra nekenksmingi ir gali suteikti ląstelėms gydymą. Kurdami šių AAV plazmides, mokslininkai įterpia terapinį geną tarp sekų, vadinamų ITR, kurios atlieka lemiamą vaidmenį užtikrinant, kad genas būtų supakuotas į virusą pristatymui. Šios sekos iš esmės siunčia ląstelėms biologinį signalą, kuriame sakoma: „Aš priklausau šiam virusui“. Tačiau komanda nustatė, kad apie 40% tyrime dalyvavusių AAV plazmidžių turėjo mutacijų ITR regionuose, kurios gali iškreipti šią svarbią žinią. Jei mokslininkai naudotų šias netinkamai sukurtas plazmides, jų genų terapija gali neveikti – ir gali prireikti daug laiko, kol mokslininkai išsiaiškins, kodėl.

Stenfordo medicinos mokyklos Kalifornijoje pediatrijos ir genetikos specialistas Markas Kay'us taip pat matė, kad plazmidės klaidos gali atidėti laboratorinius projektus. Tačiau jis įsitikinęs, kad mokslininkai gali nustatyti ir ištaisyti šias klaidas. Jis sako, kad genų terapijos tyrėjai žino apie galimas ITR problemas ir kad klinikinėje aplinkoje klaidos yra mažai tikėtinos. Taip yra todėl, kad reguliavimo agentūros, tokios kaip JAV Maisto ir vaistų administracija, turi griežtus standartus, pagal kuriuos tyrėjai turi atidžiai išanalizuoti savo plazmides prieš jas naudodami klinikoje.

Nakai sako, kad plazmidžių klaidų tikrinimas naudojant seką gali įspėti tyrėjus apie tyrime išryškintas problemas. Kai kurios įmonės, įskaitant Plasmidsaurus iš Eugene, Oregone ir Elim Biopharmaceuticals Hayward, Kalifornijoje, siūlo plazmidžių seką už maždaug 15,00 USD už mėginį, sako Nakai, neturintis finansinių interesų nė vienoje įmonėje. Jis taip pat rekomenduoja naujiems laboratorijos nariams skirti laiko mokytis iš patyrusių plazmidžių kūrėjų; Jis sako, kad tai sunkus, rankų darbo procesas, tačiau jei padarysite klaidą, galite sugaišti daug laiko ir pinigų.

Kitas būdas laboratorijoms išvengti problemų yra padaryti jų plazmidžių sekas viešai prieinamas atviros prieigos saugyklose, sako Melina Fan, ne pelno organizacijos Addgene vyriausioji mokslinė pareigūnė Votertaune, Masačusetso valstijoje. „Addgene“ teikia tokią saugyklą, sako Fanas, ir „sekvenuoja deponuotas plazmides ir dalijasi sekos duomenimis per svetainę bendruomenės reikmėms“. Ji priduria, kad svarbu patikrinti plazmides.

Lahnas tikisi, kad jo komandos analizė atkreipia tyrėjų dėmesį į tai, kad šie arklio laboratorijos įrankiai dažnai laikomi savaime suprantamais dalykais. „Įrankio sveikata yra tai, apie ką žmonės negalvoja“, – sako jis, nors turėtų.