Laboratoriski izstrādātām plazmīdām, kas ir mūsdienu bioloģijas darba zirgs, ir problēmas. Pētnieki veica sistemātisku apļveida DNS struktūru novērtējumu, analizējot vairāk nekā 2500 plazmīdu, kas izgatavotas laboratorijās un nosūtītas uzņēmumam, kas sniedz tādus pakalpojumus kā struktūru iepakošana vīrusos, lai tās varētu izmantot kā gēnu terapiju. Komanda atklāja, ka gandrīz pusei plazmīdu bija dizaina kļūdas, tostarp kļūdas sekvencēs, kas ir būtiskas terapeitiskā gēna ekspresijai. Pētnieki savus rezultātus pagājušajā mēnesī publicēja iepriekš drukas serverī bioRxiv 1.

Pētījums atklāj "zināšanu trūkumu" par pareizu plazmīdu kvalitātes kontroles veikšanu laboratorijā, saka Hiroyuki Nakai, Oregonas Veselības un zinātnes universitātes ģenētiķis, kurš nebija iesaistīts darbā. Viņš jau bija pamanījis problēmas ar laboratorijā ražotām plazmīdām, taču viņu pārsteidza pētījumā atklāto kļūdu biežums. Viņš piebilst, ka, iespējams, ir publicēti daudzi zinātniski raksti, kuru rezultāti nav atkārtojami plazmīdu dizaina kļūdu dēļ.

Izniekots laiks

Plazmīdas ir populāri instrumenti bioloģijas laboratorijās, kā baktērijas, tostarp plaši izmantots paraugorganismsEscherichia coli, kas izmanto struktūras gēnu uzglabāšanai un apmaiņai. Tas nozīmē, ka biologi var izveidot dizaineru plazmīdas, kas satur dažādus interesējošos gēnus, un pēc tamE.colipārliecināt viņus tos ierakstīt un izgatavot daudzas no tām kopijas.

Brūss Lāns, galvenais zinātnieks VectorBuilder, Čikāgā, Ilinoisā bāzētā uzņēmumā, kas nodrošina gēnu piegādes rīkus, saka, ka viņš un citi biologi gadiem ilgi ir pamanījuši problēmas ar plazmīdu kvalitāti. Kad Lāns bija Čikāgas universitātes profesors, viņa laboratorijas absolvents sešus mēnešus pavadīja, reproducējot divas plazmīdas, par kurām ziņots zinātniskajā literatūrā. "Mēs nedomājām par plazmīdu kvalitāti, bet tad eksperiments nedarbojās", jo plazmīdās bija kļūdas, viņš saka.

Tagad VectorBuilder Lāns saka, ka problēmu redz visu laiku, tāpēc viņš nolēma to sistemātiski novērtēt. Kad klienti iesniedz bojātas plazmīdas, "viņi tērē daudz laika", un papildu darbības kvalitātes kontrolē palielina plazmīdu ražošanas izmaksas un to iepakošanu vīrusos, viņš saka.

VectorBuilder komandas analīze atklāja kļūdu virkni vairāk nekā 2500 novērtētajās plazmīdās. Daži saturēja gēnus, kas kodē olbaltumvielas, kas atbild parE.colibija toksiskas, kas nozīmē, ka tās varēja palēnināt vai apturēt to organismu augšanu, uz kuriem biologi paļaujas, lai replicētu savas plazmīdas. Citi, kas paredzēti iepakošanai vīrusos, kodēja proteīnus, kas bija toksiski šiem vīrusiem. Un daži saturēja atkārtotas DNS sekvences, kas var uzkrāt mutācijas plazmīdās.

Pārbauda kļūdas

Visbiežāk sastopamās kļūdas, ko atklāja Lahns un viņa kolēģi, bija saistītas ar galveno gēnu terapijas rīku. Terapijas bieži tiek iepakotas ar adeno saistītajos vīrusos (AAV), kas lielākoties ir nekaitīgi un var nodrošināt ārstēšanu šūnām. Veidojot šo AAV plazmīdas, pētnieki ievieto terapeitisko gēnu starp sekvencēm, ko sauc par ITR, kurām ir izšķiroša nozīme, nodrošinot, ka gēns tiek iesaiņots vīrusā piegādei. Šīs sekvences būtībā nosūta šūnām bioloģisku signālu, kas saka: “Es piederu šim vīrusam”. Tomēr komanda atklāja, ka aptuveni 40% no pētījumā iekļautajām AAV plazmīdām bija mutācijas ITR reģionos, kas varētu izkropļot šo svarīgo ziņojumu. Ja pētnieki izmantotu šīs nepareizi izstrādātās plazmīdas, to gēnu terapija varētu nedarboties, un zinātniekiem varētu paiet ilgs laiks, lai noskaidrotu, kāpēc.

Marks Kejs, pediatrijas un ģenētikas speciālists Stenfordas Medicīnas skolā Kalifornijā, arī ir redzējis, ka plazmīdu kļūdas var aizkavēt laboratorijas projektus. Tomēr viņš ir pārliecināts, ka zinātnieki var identificēt un labot šīs kļūdas. Viņš saka, ka gēnu terapijas pētnieki apzinās iespējamās ITR problēmas un ka klīniskajos apstākļos kļūdas ir maz ticamas. Tas ir tāpēc, ka regulējošām aģentūrām, piemēram, ASV Pārtikas un zāļu pārvaldei, ir stingri standarti, kas pieprasa pētniekiem rūpīgi analizēt savas plazmīdas pirms to izmantošanas klīnikā.

Nakai saka, ka plazmīdu kļūdu pārbaude, izmantojot secību, varētu brīdināt pētniekus par pētījumā izceltajām problēmām. Daži uzņēmumi, tostarp Plasmidsaurus Eugene, Oregon un Elim Biopharmaceuticals Hayward, Kalifornijā, piedāvā plazmīdu sekvencēšanu par aptuveni 15,00 USD par paraugu, saka Nakai, kuram nav finansiālu interešu nevienā uzņēmumā. Viņš arī iesaka jaunajiem laboratorijas dalībniekiem pavadīt laiku, mācoties no pieredzējušiem plazmīdu dizaineriem; Viņš saka, ka tas ir darbietilpīgs, ar rokām izstrādāts process, taču, ja pieļaujat kļūdu, tas var tērēt milzīgu daudzumu laika un naudas.

Vēl viens veids, kā laboratorijas izvairīties no problēmām, ir padarīt to plazmīdu sekvences publiski pieejamas brīvpiekļuves krātuvēs, saka Melina Fan, bezpeļņas Addgene galvenā zinātniskā darbiniece Votertaunā, Masačūsetsā. Addgene nodrošina šādu repozitoriju, saka Fan, un tas "sekvenē deponētās plazmīdas un koplieto secību datus, izmantojot vietni, lai tos izmantotu sabiedrībā." Plazmīdu pārbaude ir svarīga, viņa piebilst.

Lāns cer, ka viņa komandas analīze pievērš pētnieku uzmanību faktam, ka šie darba zirgu laboratorijas rīki bieži tiek uzskatīti par pašsaprotamiem. "Par instrumenta veselību cilvēki nedomā," viņš saka, lai gan vajadzētu.