In het laboratorium vervaardigde plasmiden, een werkpaard van de moderne biologie, hebben problemen. Onderzoekers voerden een systematische beoordeling uit van circulaire DNA-structuren door meer dan 2.500 plasmiden te analyseren die in laboratoria zijn gemaakt en naar een bedrijf zijn gestuurd dat diensten levert zoals het verpakken van de structuren in virussen, zodat ze kunnen worden gebruikt als gentherapieën. Het team ontdekte dat bijna de helft van de plasmiden ontwerpfouten vertoonde, waaronder fouten in sequenties die cruciaal zijn voor de expressie van een therapeutisch gen. De onderzoekers publiceerden hun resultaten vorige maand op de preprintserver bioRxiv 1.

De studie legt “een gebrek aan kennis” bloot over het uitvoeren van een goede kwaliteitscontrole van plasmiden in het laboratorium, zegt Hiroyuki Nakai, een geneticus aan de Health & Science University in Oregon, die niet bij het werk betrokken was. Hij had al problemen opgemerkt met in het laboratorium gemaakte plasmiden, maar was verrast door de frequentie van fouten die uit het onderzoek naar voren kwamen. Er zijn waarschijnlijk veel wetenschappelijke artikelen gepubliceerd waarvan de resultaten niet reproduceerbaar zijn vanwege fouten in het plasmideontwerp, voegt hij eraan toe.

Verspilde tijd

Plasmiden zijn populaire hulpmiddelen in biologische laboratoria, zoals bacteriën, waaronder het veelgebruikte modelorganismeEscherichia coli, die structuren gebruiken om genen op te slaan en uit te wisselen. Dit betekent dat biologen designerplasmiden kunnen maken die verschillende interessante genen bevattenE.coliovertuig hen om deze op te nemen en er veel kopieën van te maken.

Bruce Lahn, hoofdwetenschapper bij VectorBuilder, een in Chicago, Illinois gevestigd bedrijf dat hulpmiddelen voor de levering van genen levert, zegt dat hij en andere biologen al jaren problemen met de kwaliteit van plasmiden hebben opgemerkt. Toen Lahn professor was aan de Universiteit van Chicago, bracht een afgestudeerde student in zijn laboratorium zes maanden door met het reproduceren van twee plasmiden die in de wetenschappelijke literatuur waren gerapporteerd. “We hebben niet nagedacht over de kwaliteit van de plasmiden, maar het experiment werkte niet” omdat de plasmiden fouten bevatten, zegt hij.

Nu bij VectorBuilder zegt Lahn dat hij het probleem voortdurend ziet, dus besloot hij het systematisch te evalueren. Als klanten defecte plasmiden indienen, "verspillen ze veel tijd", en de extra stappen in de kwaliteitscontrole verhogen de kosten voor het produceren van de plasmiden en het verpakken ervan in virussen, zegt hij.

De analyse van het VectorBuilder-team bracht een mengelmoes van fouten aan het licht in de meer dan 2.500 geëvalueerde plasmiden. Sommige bevatten genen die codeerden voor eiwitten die hiervoor verantwoordelijk zijnE.coliwaren giftig, wat betekent dat ze de groei van de organismen waarvan biologen afhankelijk zijn om hun plasmiden te repliceren, kunnen vertragen of stoppen. Anderen, bedoeld om in virussen te worden verpakt, codeerden voor eiwitten die giftig waren voor die virussen. En sommige bevatten repetitieve DNA-sequenties die mutaties in plasmiden kunnen accumuleren.

Fouten controleren

De meest voorkomende fouten die Lahn en zijn collega's ontdekten, hielden verband met een belangrijk hulpmiddel voor gentherapie. Therapieën worden vaak verpakt in adeno-geassocieerde virussen (AAV's), die meestal onschadelijk zijn en behandelingen aan cellen kunnen leveren. Bij het maken van de plasmiden voor deze AAV's plaatsen onderzoekers een therapeutisch gen tussen sequenties, ITR's genaamd, die een cruciale rol spelen bij het garanderen dat het gen in het virus wordt verpakt voor aflevering. Deze sequenties sturen in wezen een biologisch signaal naar cellen dat zegt: ‘Ik hoor thuis in dit virus.’ Het team ontdekte echter dat ongeveer 40% van de AAV-plasmiden in het onderzoek mutaties in de ITR-regio's hadden die deze belangrijke boodschap zouden kunnen vervormen. Als onderzoekers deze verkeerd ontworpen plasmiden zouden gebruiken, zou hun gentherapie mogelijk niet werken – en het zou lang kunnen duren voordat wetenschappers erachter komen waarom.

Mark Kay, een kindergeneeskunde- en geneticaspecialist aan de Stanford School of Medicine in Californië, heeft ook uit de eerste hand gezien dat plasmidefouten laboratoriumprojecten kunnen vertragen. Hij heeft er echter vertrouwen in dat wetenschappers deze fouten kunnen identificeren en corrigeren. Hij zegt dat onderzoekers op het gebied van gentherapie zich bewust zijn van mogelijke ITR-problemen en dat fouten in klinische omgevingen onwaarschijnlijk zijn. Dat komt omdat regelgevende instanties zoals de Amerikaanse Food and Drug Administration strikte normen hanteren die vereisen dat onderzoekers hun plasmiden zorgvuldig analyseren voordat ze in de kliniek worden gebruikt.

Nakai zegt dat het controleren van plasmiden op fouten door middel van sequencing onderzoekers zou kunnen waarschuwen voor de problemen die in het onderzoek naar voren komen. Sommige bedrijven, waaronder Plasmidsaurus in Eugene, Oregon, en Elim Biopharmaceuticals in Hayward, Californië, bieden plasmidesequencing aan voor ongeveer $ 15,00 per monster, zegt Nakai, die geen financieel belang heeft in beide bedrijven. Hij beveelt ook aan dat nieuwe laboratoriumleden tijd besteden aan het leren van ervaren plasmideontwerpers; Het is een arbeidsintensief, handmatig proces, zegt hij, maar als je een fout maakt, kan dat enorm veel tijd en geld verspillen.

Een andere manier waarop laboratoria problemen kunnen vermijden, is door hun plasmidesequenties publiekelijk beschikbaar te maken in open-access repositories, zegt Melina Fan, hoofd wetenschappelijk directeur bij de non-profitorganisatie Addgene in Watertown, Massachusetts. Addgene biedt zo’n repository, zegt Fan, en het ‘sequenteert de gedeponeerde plasmiden en deelt de sequentiegegevens via de website voor gebruik door de gemeenschap.’ Het controleren van plasmiden is belangrijk, voegt ze eraan toe.

Lahn hoopt dat de analyse van zijn team de aandacht van onderzoekers vestigt op het feit dat deze laboratoriumhulpmiddelen vaak als vanzelfsprekend worden beschouwd. “De gezondheid van de tool is iets waar mensen niet aan denken”, zegt hij, ook al zouden ze dat wel moeten doen.