Laboratoriekonstruerte plasmider, en arbeidshest innen moderne biologi, har problemer. Forskere gjennomførte en systematisk vurdering av sirkulære DNA-strukturer ved å analysere mer enn 2500 plasmider laget i laboratorier og sendt til et selskap som tilbyr tjenester som å pakke strukturene i virus slik at de kan brukes som genterapi. Teamet fant at nesten halvparten av plasmidene hadde designfeil, inkludert feil i sekvenser som er kritiske for uttrykket av et terapeutisk gen. Forskerne publiserte resultatene sine i forrige måned på preprint-serveren bioRxiv 1.

Studien avslører «mangel på kunnskap» om å gjennomføre riktig kvalitetskontroll av plasmider i laboratoriet, sier Hiroyuki Nakai, en genetiker ved Health & Science University i Oregon som ikke var involvert i arbeidet. Han hadde allerede lagt merke til problemer med laboratorielagde plasmider, men ble overrasket over hyppigheten av feil som ble avdekket av studien. Det er sannsynligvis mange vitenskapelige artikler som har blitt publisert der resultatene ikke er reproduserbare på grunn av feil i plasmiddesign, legger han til.

Bortkastet tid

Plasmider er populære verktøy i biologiske laboratorier, som bakterier, inkludert den mye brukte modellorganismenEscherichia coli, som bruker strukturer til å lagre og utveksle gener. Dette betyr at biologer kan lage designerplasmider som inneholder ulike gener av interesse, og deretterE.coliovertale dem til å ta opp disse og lage mange kopier av dem.

Bruce Lahn, sjefforsker ved VectorBuilder, et Chicago, Illinois-basert selskap som tilbyr genleveringsverktøy, sier at han og andre biologer har lagt merke til problemer med plasmidkvaliteten i årevis. Da Lahn var professor ved University of Chicago, brukte en doktorgradsstudent i laboratoriet hans seks måneder på å reprodusere to plasmider som var rapportert i vitenskapelig litteratur. «Vi tenkte ikke på kvaliteten på plasmidene, men så fungerte ikke eksperimentet» fordi plasmidene inneholdt feil, sier han.

Nå hos VectorBuilder sier Lahn at han ser problemet hele tiden - så han bestemte seg for å systematisk evaluere det. Når kunder sender inn defekte plasmider, «sløser de bort mye tid», og de ekstra trinnene i kvalitetskontrollen øker kostnadene ved å produsere plasmidene og pakke dem inn i virus, sier han.

VectorBuilder-teamets analyse avslørte en mengde feil i de mer enn 2500 plasmidene som ble evaluert. Noen inneholdt gener som kodet for proteiner som er ansvarlige forE.colivar giftige, noe som betyr at de kunne bremse eller stoppe veksten av organismene som biologer er avhengige av for å replikere plasmidene deres. Andre, beregnet for pakking i virus, kodet proteiner som var giftige for disse virusene. Og noen inneholdt repeterende DNA-sekvenser som kan akkumulere mutasjoner i plasmider.

Sjekker feil

De vanligste feilene Lahn og hans kolleger fant var assosiert med et sentralt genterapiverktøy. Terapi er ofte pakket i adeno-assosierte virus (AAV), som stort sett er ufarlige og kan levere behandlinger til celler. Når forskerne lager plasmidene for disse AAV-ene, legger forskerne et terapeutisk gen mellom sekvenser kalt ITR-er, som spiller en kritisk rolle for å sikre at genet pakkes inn i viruset for levering. Disse sekvensene sender i hovedsak et biologisk signal til celler som sier "Jeg hører hjemme i dette viruset." Imidlertid fant teamet at rundt 40 % av AAV-plasmidene i studien hadde mutasjoner i ITR-regionene som kunne forvrenge denne viktige meldingen. Hvis forskere brukte disse feildesignede plasmidene, kan det hende at genterapien deres ikke fungerer - og det kan ta lang tid for forskere å finne ut hvorfor.

Mark Kay, en pediatri- og genetikkspesialist ved Stanford School of Medicine i California, har også sett på egen hånd at plasmidfeil kan forsinke laboratorieprosjekter. Han er imidlertid sikker på at forskere kan identifisere og rette opp disse feilene. Han sier genterapiforskere er klar over mulige ITR-problemer og at feil er usannsynlig i kliniske omgivelser. Det er fordi regulatoriske byråer som US Food and Drug Administration har strenge standarder som krever at forskere nøye analyserer plasmidene deres før de brukes på klinikken.

Nakai sier at å sjekke plasmider for feil gjennom sekvensering kan varsle forskerne om problemene som er fremhevet i studien. Noen selskaper, inkludert Plasmidsaurus i Eugene, Oregon, og Elim Biopharmaceuticals i Hayward, California, tilbyr plasmidsekvensering for rundt $15,00 per prøve, sier Nakai, som ikke har noen økonomisk interesse i noen av selskapene. Han anbefaler også at nye laboratoriemedlemmer bruker tid på å lære av erfarne plasmiddesignere; Det er en arbeidskrevende, håndlaget prosess, sier han, men hvis du gjør en feil kan det kaste bort enormt mye tid og penger.

En annen måte for laboratorier å unngå problemer på er å gjøre plasmidsekvensene deres offentlig tilgjengelige i depoter med åpen tilgang, sier Melina Fan, vitenskapelig sjef ved den ideelle organisasjonen Addgene i Watertown, Massachusetts. Addgene gir et slikt depot, sier Fan, og det "sekvenserer de deponerte plasmidene og deler sekvensdataene gjennom nettstedet for fellesskapsbruk." Å sjekke plasmider er viktig, legger hun til.

Lahn håper teamets analyse trekker forskernes oppmerksomhet til det faktum at disse laboratorieverktøyene for arbeidshesten ofte tas for gitt. "Helsen til verktøyet er noe folk ikke tenker på," sier han, selv om de burde.