Plazmidy otrzymane w laboratorium, będące koniem pociągowym współczesnej biologii, borykają się z problemami. Naukowcy przeprowadzili systematyczną ocenę kolistych struktur DNA, analizując ponad 2500 plazmidów wytworzonych w laboratoriach i przesłanych do firmy świadczącej usługi takie jak pakowanie struktur w wirusy, aby można je było wykorzystać w terapiach genowych. Zespół odkrył, że prawie połowa plazmidów zawierała błędy projektowe, w tym błędy w sekwencjach krytycznych dla ekspresji genu terapeutycznego. Naukowcy opublikowali swoje wyniki w zeszłym miesiącu na serwerze preprintów bioRxiv 1.

Badanie obnaża „brak wiedzy” na temat prowadzenia właściwej kontroli jakości plazmidów w laboratorium, mówi Hiroyuki Nakai, genetyk z Health & Science University w Oregonie, który nie był zaangażowany w prace. Zauważył już problemy z plazmidami wytwarzanymi w laboratorium, ale był zaskoczony częstotliwością błędów wykrytych w badaniu. Prawdopodobnie opublikowano wiele artykułów naukowych, których wyników nie można odtworzyć ze względu na błędy w projekcie plazmidu – dodaje.

Zmarnowany czas

Plazmidy są popularnymi narzędziami w laboratoriach biologicznych, podobnie jak bakterie, w tym szeroko stosowany organizm modelowyEscherichia coli, które wykorzystują struktury do przechowywania i wymiany genów. Oznacza to, że biolodzy mogą tworzyć designerskie plazmidy zawierające różne interesujące geny, a następnieE.coliprzekonać ich, aby je nagrali i sporządzili wiele kopii.

Bruce Lahn, główny naukowiec w VectorBuilder, firmie z siedzibą w Chicago w stanie Illinois, która dostarcza narzędzia do dostarczania genów, twierdzi, że on i inni biolodzy od lat zauważają problemy z jakością plazmidów. Kiedy Lahn był profesorem na Uniwersytecie w Chicago, absolwent w jego laboratorium spędził sześć miesięcy na reprodukcji dwóch plazmidów, o których donoszono w literaturze naukowej. „Nie myśleliśmy o jakości plazmidów, ale eksperyment się nie udał”, ponieważ plazmidy zawierały błędy – mówi.

Lahn twierdzi, że obecnie w VectorBuilder widzi problem przez cały czas, dlatego zdecydował się go systematycznie oceniać. Kiedy klienci dostarczają wadliwe plazmidy, „tracą dużo czasu”, a dodatkowe etapy kontroli jakości zwiększają koszty produkcji plazmidów i pakowania ich w wirusy – mówi.

Analiza zespołu VectorBuilder ujawniła mieszankę błędów w ponad 2500 ocenionych plazmidach. Niektóre zawierały geny kodujące odpowiedzialne za nie białkaE.colibyły toksyczne, co oznaczało, że mogły spowolnić lub zatrzymać wzrost organizmów, na których biolodzy polegają przy replikacji swoich plazmidów. Inne, przeznaczone do pakowania w wirusy, kodowały białka toksyczne dla tych wirusów. Niektóre zawierały powtarzające się sekwencje DNA, które mogą kumulować mutacje w plazmidach.

Sprawdzanie błędów

Najczęstsze błędy znalezione przez Lahna i jego współpracowników były powiązane z kluczowym narzędziem terapii genowej. Terapie są często opakowane w wirusy związane z adenowirusami (AAV), które są w większości nieszkodliwe i mogą zapewniać leczenie komórkom. Tworząc plazmidy dla tych AAV, badacze umieszczają terapeutyczny gen pomiędzy sekwencjami zwanymi ITR, które odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu zapakowania genu do wirusa w celu jego dostarczenia. Sekwencje te zasadniczo wysyłają sygnał biologiczny do komórek, który mówi: „Należę do tego wirusa”. Zespół odkrył jednak, że około 40% plazmidów AAV objętych badaniem miało mutacje w regionach ITR, które mogą zniekształcić ten ważny komunikat. Jeśli badacze wykorzystają te źle zaprojektowane plazmidy, terapia genowa może nie zadziałać, a ustalenie przyczyny może zająć dużo czasu.

Mark Kay, specjalista pediatrii i genetyki w Stanford School of Medicine w Kalifornii, również widział na własne oczy, że błędy plazmidowe mogą opóźniać projekty laboratoryjne. Jest jednak przekonany, że naukowcom uda się zidentyfikować i skorygować te błędy. Mówi, że badacze zajmujący się terapią genową są świadomi możliwych problemów z ITR i że w warunkach klinicznych błędy są mało prawdopodobne. Dzieje się tak dlatego, że agencje regulacyjne, takie jak amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków, mają rygorystyczne standardy, które wymagają od badaczy dokładnej analizy plazmidów przed użyciem ich w klinice.

Nakai twierdzi, że sprawdzanie plazmidów pod kątem błędów poprzez sekwencjonowanie może zwrócić uwagę badaczy na problemy podkreślone w badaniu. Niektóre firmy, w tym Plasmidsaurus w Eugene w stanie Oregon i Elim Biopharmaceuticals w Hayward w Kalifornii, oferują sekwencjonowanie plazmidów za około 15 dolarów za próbkę, mówi Nakai, który nie ma interesów finansowych w żadnej z tych firm. Zaleca także, aby nowi członkowie laboratorium spędzali czas na uczeniu się od doświadczonych projektantów plazmidów; Mówi, że jest to pracochłonny i ręczny proces, ale jeśli popełnisz błąd, może to spowodować stratę ogromnej ilości czasu i pieniędzy.

Innym sposobem na uniknięcie problemów przez laboratoria jest publiczne udostępnienie sekwencji plazmidów w ogólnodostępnych repozytoriach, mówi Melina Fan, dyrektor naukowy w organizacji non-profit Addgene w Watertown w stanie Massachusetts. Addgene zapewnia takie repozytorium, mówi Fan, i „sekwencjonuje zdeponowane plazmidy i udostępnia dane dotyczące sekwencji za pośrednictwem witryny internetowej do użytku społeczności”. Sprawdzanie plazmidów jest ważne – dodaje.

Lahn ma nadzieję, że analiza jego zespołu zwróci uwagę badaczy na fakt, że te narzędzia laboratoryjne są często traktowane jako coś oczywistego. „Ludzie nie myślą o zdrowiu narzędzia” – mówi, chociaż powinni.