Os plasmídeos projetados em laboratório, um carro-chefe da biologia moderna, têm problemas. Os pesquisadores realizaram uma avaliação sistemática de estruturas circulares de DNA, analisando mais de 2.500 plasmídeos produzidos em laboratórios e enviados a uma empresa que presta serviços como empacotamento de estruturas dentro de vírus para que possam ser usadas como terapias genéticas. A equipe descobriu que quase metade dos plasmídeos apresentava erros de design, incluindo erros em sequências críticas para a expressão de um gene terapêutico. Os pesquisadores publicaram seus resultados no mês passado no servidor de pré-impressão bioRxiv 1.

O estudo expõe “uma falta de conhecimento” sobre a condução do controle de qualidade adequado dos plasmídeos em laboratório, diz Hiroyuki Nakai, geneticista da Health & Science University, em Oregon, que não esteve envolvido no trabalho. Ele já havia notado problemas com plasmídeos produzidos em laboratório, mas ficou surpreso com a frequência de erros descobertos pelo estudo. Provavelmente existem muitos artigos científicos publicados cujos resultados não são reproduzíveis devido a erros no design do plasmídeo, acrescenta.

Tempo perdido

Os plasmídeos são ferramentas populares em laboratórios de biologia, como bactérias, incluindo o organismo modelo amplamente utilizadoEscherichia coli, que utilizam estruturas para armazenar e trocar genes. Isso significa que os biólogos podem criar plasmídeos projetados que contenham vários genes de interesse e, em seguida,E.coliconvencê-los a registrá-los e fazer muitas cópias deles.

Bruce Lahn, cientista-chefe da VectorBuilder, uma empresa com sede em Chicago, Illinois, que fornece ferramentas de entrega de genes, diz que ele e outros biólogos notaram problemas com a qualidade dos plasmídeos durante anos. Quando Lahn era professor na Universidade de Chicago, um estudante de pós-graduação em seu laboratório passou seis meses reproduzindo dois plasmídeos relatados na literatura científica. “Não pensamos na qualidade dos plasmídeos, mas o experimento não funcionou” porque os plasmídeos continham erros, diz ele.

Agora no VectorBuilder, Lahn diz que vê o problema o tempo todo - então decidiu avaliá-lo sistematicamente. Quando os clientes enviam plasmídeos defeituosos, “eles perdem muito tempo”, e as etapas extras no controle de qualidade aumentam o custo de produção dos plasmídeos e de empacotamento deles em vírus, diz ele.

A análise da equipe do VectorBuilder revelou uma mistura de erros nos mais de 2.500 plasmídeos avaliados. Alguns continham genes que codificavam proteínas responsáveis ​​porE.colieram tóxicos, o que significa que poderiam retardar ou interromper o crescimento dos organismos nos quais os biólogos dependem para replicar seus plasmídeos. Outros, destinados a serem empacotados em vírus, codificavam proteínas que eram tóxicas para esses vírus. E alguns continham sequências repetitivas de DNA que podem acumular mutações em plasmídeos.

Verificando erros

Os erros mais comuns que Lahn e seus colegas encontraram estavam associados a uma ferramenta chave de terapia genética. As terapias são frequentemente embaladas em vírus adeno-associados (AAVs), que são em sua maioria inofensivos e podem fornecer tratamentos às células. Ao criar os plasmídeos para esses AAVs, os pesquisadores colocam um gene terapêutico entre sequências chamadas ITRs, que desempenham um papel crítico para garantir que o gene seja empacotado no vírus para entrega. Estas sequências enviam essencialmente um sinal biológico às células que diz “Eu pertenço a este vírus”. No entanto, a equipe descobriu que cerca de 40% dos plasmídeos AAV no estudo apresentavam mutações nas regiões ITR que poderiam distorcer esta importante mensagem. Se os investigadores usassem estes plasmídeos mal concebidos, a sua terapia genética poderia não funcionar – e poderia levar muito tempo para os cientistas descobrirem porquê.

Mark Kay, especialista em pediatria e genética da Faculdade de Medicina de Stanford, na Califórnia, também viu em primeira mão que erros de plasmídeo podem atrasar projetos de laboratório. No entanto, ele está confiante de que os cientistas poderão identificar e corrigir esses erros. Ele diz que os pesquisadores de terapia genética estão cientes dos possíveis problemas de ITR e que erros são improváveis ​​em ambientes clínicos. Isto porque agências reguladoras como a Food and Drug Administration dos EUA têm padrões rigorosos que exigem que os investigadores analisem cuidadosamente os seus plasmídeos antes de os utilizarem na clínica.

Nakai diz que verificar se há erros nos plasmídeos por meio do sequenciamento pode alertar os pesquisadores sobre os problemas destacados no estudo. Algumas empresas, incluindo a Plasmidsaurus em Eugene, Oregon, e a Elim Biopharmaceuticals em Hayward, Califórnia, oferecem sequenciação de plasmídeos por cerca de 15 dólares por amostra, diz Nakai, que não tem interesse financeiro em nenhuma das empresas. Ele também recomenda que os novos membros do laboratório passem algum tempo aprendendo com designers de plasmídeos experientes; É um processo trabalhoso e artesanal, diz ele, mas se você cometer um erro, poderá desperdiçar uma enorme quantidade de tempo e dinheiro.

Outra forma de os laboratórios evitarem problemas é disponibilizar publicamente as suas sequências de plasmídeos em repositórios de acesso aberto, diz Melina Fan, diretora científica da organização sem fins lucrativos Addgene em Watertown, Massachusetts. Addgene fornece esse repositório, diz Fan, e “sequencia os plasmídeos depositados e compartilha os dados da sequência por meio do site para uso da comunidade”. Verificar os plasmídeos é importante, acrescenta ela.

Lahn espera que a análise de sua equipe chame a atenção dos pesquisadores para o fato de que essas ferramentas laboratoriais são muitas vezes tidas como certas. “A saúde da ferramenta é algo em que as pessoas não pensam”, diz ele, embora devessem.