Plasmidele realizate în laborator, un cal de bătaie al biologiei moderne, au probleme. Cercetătorii au efectuat o evaluare sistematică a structurilor circulare de ADN analizând peste 2.500 de plasmide realizate în laboratoare și trimise unei companii care oferă servicii precum ambalarea structurilor în viruși, astfel încât acestea să poată fi utilizate ca terapii genetice. Echipa a descoperit că aproape jumătate dintre plasmide au avut erori de proiectare, inclusiv erori în secvențele critice pentru exprimarea unei gene terapeutice. Cercetătorii și-au publicat rezultatele luna trecută pe serverul de preprint bioRxiv 1.

Studiul expune „o lipsă de cunoștințe” despre efectuarea unui control adecvat al calității plasmidelor în laborator, spune Hiroyuki Nakai, genetician la Universitatea de Sănătate și Știință din Oregon, care nu a fost implicat în muncă. El a observat deja probleme cu plasmidele făcute în laborator, dar a fost surprins de frecvența erorilor descoperite de studiu. Există probabil multe lucrări științifice care au fost publicate pentru care rezultatele nu sunt reproductibile din cauza erorilor în designul plasmidelor, adaugă el.

Timp pierdut

Plasmidele sunt instrumente populare în laboratoarele de biologie, ca bacterii, inclusiv organismul model larg utilizatEscherichia coli, care folosesc structuri pentru stocarea și schimbul de gene. Aceasta înseamnă că biologii pot crea plasmide de designer care conțin diverse gene de interes și apoiE.coliconvinge-i să le înregistreze și să facă multe copii ale acestora.

Bruce Lahn, om de știință șef la VectorBuilder, o companie cu sediul în Chicago, Illinois, care furnizează instrumente de livrare a genelor, spune că el și alți biologi au observat probleme cu calitatea plasmidelor de ani de zile. Când Lahn era profesor la Universitatea din Chicago, un student absolvent din laboratorul său a petrecut șase luni reproducând două plasmide care fuseseră raportate în literatura științifică. „Nu ne-am gândit la calitatea plasmidelor, dar apoi experimentul nu a funcționat”, deoarece plasmidele conțineau erori, spune el.

Acum, la VectorBuilder, Lahn spune că vede problema tot timpul - așa că a decis să o evalueze sistematic. Atunci când clienții trimit plasmide defecte, „pierd mult timp”, iar pașii suplimentari în controlul calității cresc costul producerii plasmidelor și ambalării lor în viruși, spune el.

Analiza echipei VectorBuilder a dezvăluit un amestec de erori în cele peste 2.500 de plasmide evaluate. Unele conțineau gene care codificau proteinele responsabile pentruE.colierau toxice, ceea ce înseamnă că puteau încetini sau opri creșterea organismelor pe care se bazează biologii pentru a-și replica plasmidele. Alții, destinate ambalării în viruși, au codificat proteine ​​care erau toxice pentru acești viruși. Și unele au conținut secvențe repetitive de ADN care pot acumula mutații în plasmide.

Verificarea erorilor

Cele mai frecvente erori găsite de Lahn și colegii săi au fost legate de un instrument cheie de terapie genetică. Terapiile sunt adesea ambalate în virusuri adeno-asociate (AAV), care sunt în mare parte inofensive și pot oferi tratamente celulelor. Atunci când creează plasmidele pentru aceste AAV, cercetătorii fac sandwich o genă terapeutică între secvențele numite ITR, care joacă un rol critic în asigurarea că gena este ambalată în virus pentru livrare. Aceste secvențe trimit în esență un semnal biologic celulelor care spune „Aparțin acestui virus”. Cu toate acestea, echipa a descoperit că aproximativ 40% dintre plasmidele AAV din studiu au avut mutații în regiunile ITR care ar putea distorsiona acest mesaj important. Dacă cercetătorii ar folosi aceste plasmide proiectate greșit, terapia lor genică ar putea să nu funcționeze - și ar putea dura mult timp pentru ca oamenii de știință să descopere de ce.

Mark Kay, specialist în pediatrie și genetică la Stanford School of Medicine din California, a văzut de asemenea că erorile plasmidei pot întârzia proiectele de laborator. Cu toate acestea, el este încrezător că oamenii de știință pot identifica și corecta aceste erori. El spune ca cercetatorii de terapie genetica sunt constienti de posibile probleme ITR si ca erorile sunt putin probabile in setarile clinice. Acest lucru se datorează faptului că agențiile de reglementare precum Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente au standarde stricte care impun cercetătorilor să-și analizeze cu atenție plasmidele înainte de a le folosi în clinică.

Nakai spune că verificarea plasmidelor pentru erori prin secvențiere ar putea alerta cercetătorii asupra problemelor evidențiate în studiu. Unele companii, inclusiv Plasmidsaurus din Eugene, Oregon și Elim Biopharmaceuticals din Hayward, California, oferă secvențierea plasmidelor pentru aproximativ 15,00 USD per probă, spune Nakai, care nu are niciun interes financiar în nicio companie. De asemenea, el recomanda ca noii membri ai laboratorului sa petreaca timp invatand de la designeri experimentati de plasmide; Este un proces laborios, lucrat manual, spune el, dar dacă faci o greșeală, poate pierde o cantitate enormă de timp și bani.

O altă modalitate prin care laboratoarele pot evita problemele este de a face secvențele lor plasmide disponibile public în arhivele cu acces deschis, spune Melina Fan, director științific la organizația nonprofit Addgene din Watertown, Massachusetts. Addgene oferă un astfel de depozit, spune Fan, și „secvențiază plasmidele depuse și partajează datele secvenței prin intermediul site-ului web pentru uzul comunității”. Verificarea plasmidelor este importantă, adaugă ea.

Lahn speră că analiza echipei sale atrage atenția cercetătorilor asupra faptului că aceste instrumente de laborator sunt adesea luate de la sine înțeles. „Sănătatea instrumentului este ceva la care oamenii nu se gândesc”, spune el, deși ar trebui.