Laboratórne skonštruované plazmidy, ťažný kôň modernej biológie, majú problémy. Výskumníci vykonali systematické hodnotenie kruhových štruktúr DNA analýzou viac ako 2 500 plazmidov vyrobených v laboratóriách a odoslaných spoločnosti, ktorá poskytuje služby, ako je balenie štruktúr do vírusov, aby sa mohli použiť ako génové terapie. Tím zistil, že takmer polovica plazmidov mala chyby v dizajne, vrátane chýb v sekvenciách kritických pre expresiu terapeutického génu. Výskumníci zverejnili svoje výsledky minulý mesiac na predtlačovom serveri bioRxiv 1.

Štúdia odhaľuje „nedostatok vedomostí“ o riadnej kontrole kvality plazmidov v laboratóriu, hovorí Hiroyuki Nakai, genetik z Health & Science University v Oregone, ktorý sa na práci nezúčastnil. Už si všimol problémy s plazmidmi vyrobenými v laboratóriu, ale prekvapila ho frekvencia chýb, ktoré štúdia odhalila. Existuje pravdepodobne veľa vedeckých prác, ktoré boli publikované, pre ktoré výsledky nie sú reprodukovateľné kvôli chybám v dizajne plazmidov, dodáva.

Stratený čas

Plazmidy sú populárne nástroje v biologických laboratóriách, ako baktérie, vrátane široko používaného modelového organizmuEscherichia coli, ktoré využívajú štruktúry na ukladanie a výmenu génov. To znamená, že biológovia môžu vytvoriť dizajnérske plazmidy, ktoré obsahujú rôzne zaujímavé gény, a potomE.colipresvedčte ich, aby ich zaznamenali a urobili z nich veľa kópií.

Bruce Lahn, hlavný vedec spoločnosti VectorBuilder, spoločnosti so sídlom v Chicagu v štáte Illinois, ktorá poskytuje nástroje na dodávanie génov, hovorí, že on a iní biológovia už roky zaznamenávajú problémy s kvalitou plazmidov. Keď bol Lahn profesorom na Chicagskej univerzite, postgraduálny študent v jeho laboratóriu strávil šesť mesiacov reprodukovaním dvoch plazmidov, ktoré boli uvedené vo vedeckej literatúre. "Nepremýšľali sme o kvalite plazmidov, ale potom experiment nefungoval", pretože plazmidy obsahovali chyby, hovorí.

Teraz vo VectorBuilder Lahn hovorí, že problém vidí neustále – preto sa rozhodol systematicky ho vyhodnocovať. Keď zákazníci predložia chybné plazmidy, „strávia veľa času“ a dodatočné kroky pri kontrole kvality zvyšujú náklady na výrobu plazmidov a ich zabalenie do vírusov, hovorí.

Analýza tímu VectorBuilder odhalila množstvo chýb vo viac ako 2 500 hodnotených plazmidom. Niektoré obsahovali gény, ktoré kódovali zodpovedné proteínyE.coliboli toxické, čo znamená, že mohli spomaliť alebo zastaviť rast organizmov, na ktoré sa biológovia spoliehajú pri replikácii svojich plazmidov. Iné, určené na balenie do vírusov, kódovali proteíny, ktoré boli pre tieto vírusy toxické. A niektoré obsahovali opakujúce sa sekvencie DNA, ktoré môžu akumulovať mutácie v plazmidoch.

Kontrola chýb

Najčastejšie chyby, ktoré Lahn a jeho kolegovia našli, súviseli s kľúčovým nástrojom génovej terapie. Terapie sú často zabalené v adeno-asociovaných vírusoch (AAV), ktoré sú väčšinou neškodné a môžu bunkám poskytnúť liečbu. Pri vytváraní plazmidov pre tieto AAV výskumníci vkladajú terapeutický gén medzi sekvencie nazývané ITR, ktoré zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri zabezpečovaní toho, aby bol gén zabalený do vírusu na doručenie. Tieto sekvencie v podstate posielajú bunkám biologický signál, ktorý hovorí: „Patrím do tohto vírusu“. Tím však zistil, že asi 40% plazmidov AAV v štúdii malo mutácie v oblastiach ITR, ktoré by mohli skresliť túto dôležitú správu. Ak by výskumníci použili tieto nesprávne navrhnuté plazmidy, ich génová terapia by nemusela fungovať - ​​a vedcom by mohlo trvať dlho, kým prídu na to, prečo.

Mark Kay, špecialista na pediatriu a genetiku na Stanfordskej lekárskej fakulte v Kalifornii, tiež z prvej ruky videl, že plazmidové chyby môžu oneskoriť laboratórne projekty. Je však presvedčený, že vedci dokážu tieto chyby identifikovať a opraviť. Hovorí, že výskumníci génovej terapie sú si vedomí možných problémov s ITR a že chyby sú v klinickom prostredí nepravdepodobné. Je to preto, že regulačné agentúry, ako je US Food and Drug Administration, majú prísne normy, ktoré vyžadujú, aby výskumníci starostlivo analyzovali svoje plazmidy pred ich použitím na klinike.

Nakai hovorí, že kontrola chýb plazmidov prostredníctvom sekvenovania by mohla upozorniť výskumníkov na problémy zdôraznené v štúdii. Niektoré spoločnosti, vrátane Plasmidsaurus v Eugene, Oregon, a Elim Biopharmaceuticals v Hayward, Kalifornia, ponúkajú sekvenovanie plazmidov za približne 15,00 dolárov za vzorku, hovorí Nakai, ktorý nemá finančný záujem ani v jednej spoločnosti. Odporúča tiež, aby noví členovia laboratória strávili čas učením sa od skúsených dizajnérov plazmidov; Je to namáhavý, ručne vyrobený proces, hovorí, ale ak urobíte chybu, môže to stratiť obrovské množstvo času a peňazí.

Ďalším spôsobom, ako sa laboratóriá vyhnúť problémom, je sprístupniť svoje plazmidové sekvencie verejnosti v úložiskách s otvoreným prístupom, hovorí Melina Fan, vedúca vedecká pracovníčka v neziskovej organizácii Addgene vo Watertown, Massachusetts. Addgene poskytuje takéto úložisko, hovorí Fan, a „sekvenuje uložené plazmidy a zdieľa sekvenčné údaje prostredníctvom webovej stránky pre komunitné použitie“. Kontrola plazmidov je dôležitá, dodáva.

Lahn dúfa, že analýza jeho tímu upriami pozornosť výskumníkov na skutočnosť, že tieto pracovné nástroje sú často považované za samozrejmosť. „Zdravie nástroja je niečo, o čom ľudia nepremýšľajú,“ hovorí, aj keď by mali.