Laboratorijski izdelani plazmidi, vlečni konj sodobne biologije, imajo težave. Raziskovalci so izvedli sistematično oceno krožnih struktur DNK z analizo več kot 2500 plazmidov, narejenih v laboratorijih in poslanih podjetju, ki nudi storitve, kot je pakiranje struktur znotraj virusov, da jih je mogoče uporabiti kot genske terapije. Skupina je ugotovila, da ima skoraj polovica plazmidov napake pri načrtovanju, vključno z napakami v sekvencah, ki so kritične za izražanje terapevtskega gena. Raziskovalci so objavili svoje rezultate prejšnji mesec na strežniku za prednatis bioRxiv 1.

Študija razkriva "pomanjkanje znanja" o izvajanju ustrezne kontrole kakovosti plazmidov v laboratoriju, pravi Hiroyuki Nakai, genetik na Univerzi za zdravje in znanost v Oregonu, ki ni bil vključen v delo. Opazil je že težave z laboratorijsko izdelanimi plazmidi, vendar je bil presenečen nad pogostostjo napak, ki jih je odkrila študija. Verjetno je veliko objavljenih znanstvenih člankov, katerih rezultati niso ponovljivi zaradi napak v oblikovanju plazmida, dodaja.

Zapravljen čas

Plazmidi so priljubljeno orodje v bioloških laboratorijih, kot bakterije, vključno s široko uporabljenim modelnim organizmomEscherichia coli, ki uporabljajo strukture za shranjevanje in izmenjavo genov. To pomeni, da lahko biologi ustvarijo oblikovalske plazmide, ki vsebujejo različne zanimive gene, in natoE.colijih prepričati, da jih posnamejo in naredijo veliko kopij.

Bruce Lahn, glavni znanstvenik pri VectorBuilderju, podjetju s sedežem v Chicagu v Illinoisu, ki ponuja orodja za dostavo genov, pravi, da on in drugi biologi že leta opažajo težave s kakovostjo plazmidov. Ko je bil Lahn profesor na Univerzi v Chicagu, je podiplomski študent v njegovem laboratoriju šest mesecev razmnoževal dva plazmida, o katerih so poročali v znanstveni literaturi. "Nismo razmišljali o kakovosti plazmidov, potem pa poskus ni uspel", ker so plazmidi vsebovali napake, pravi.

Zdaj pri VectorBuilderju Lahn pravi, da težavo vidi ves čas – zato se je odločil, da jo bo sistematično ovrednotil. Ko stranke predložijo napačne plazmide, "izgubijo veliko časa," in dodatni koraki pri nadzoru kakovosti povečajo stroške proizvodnje plazmidov in pakiranja v viruse, pravi.

Analiza ekipe VectorBuilder je razkrila mešanico napak v več kot 2500 ocenjenih plazmidih. Nekateri so vsebovali gene, ki so kodirali beljakovine, odgovorne zaE.coliso bili strupeni, kar pomeni, da bi lahko upočasnili ali zaustavili rast organizmov, na katere se biologi zanašajo pri podvajanju svojih plazmidov. Drugi, namenjeni pakiranju v viruse, so kodirali beljakovine, ki so bile strupene za te viruse. Nekateri so vsebovali ponavljajoče se sekvence DNK, ki lahko kopičijo mutacije v plazmidih.

Preverjanje napak

Najpogostejše napake, ki so jih odkrili Lahn in njegovi sodelavci, so bile povezane s ključnim orodjem za gensko terapijo. Terapije so pogosto zapakirane v adeno-povezane viruse (AAV), ki so večinoma neškodljivi in ​​lahko celicam zagotovijo zdravljenje. Pri ustvarjanju plazmidov za te AAV raziskovalci vstavijo terapevtski gen med sekvence, imenovane ITR, ki igrajo ključno vlogo pri zagotavljanju, da je gen zapakiran v virus za dostavo. Te sekvence v bistvu pošljejo biološki signal celicam, ki pravi "Spadam v ta virus." Vendar pa je skupina ugotovila, da ima približno 40 % plazmidov AAV v študiji mutacije v regijah ITR, ki bi lahko izkrivile to pomembno sporočilo. Če bi raziskovalci uporabili te napačno zasnovane plazmide, njihova genska terapija morda ne bi delovala - in lahko traja dolgo časa, da znanstveniki ugotovijo, zakaj.

Mark Kay, specialist za pediatrijo in genetiko na Medicinski fakulteti Stanford v Kaliforniji, je prav tako iz prve roke videl, da lahko plazmidne napake upočasnijo laboratorijske projekte. Prepričan pa je, da lahko znanstveniki prepoznajo in popravijo te napake. Pravi, da se raziskovalci genske terapije zavedajo možnih težav z ITR in da so napake v kliničnih okoljih malo verjetne. To je zato, ker imajo regulativne agencije, kot je ameriška uprava za hrano in zdravila, stroge standarde, ki od raziskovalcev zahtevajo, da natančno analizirajo svoje plazmide, preden jih uporabijo v kliniki.

Nakai pravi, da bi lahko preverjanje plazmidov za napake s sekvenciranjem opozorilo raziskovalce na težave, ki so bile izpostavljene v študiji. Nekatera podjetja, vključno s Plasmidsaurusom v Eugenu v Oregonu in Elim Biopharmaceuticals v Haywardu v Kaliforniji, ponujajo sekvenciranje plazmidov za približno 15,00 $ na vzorec, pravi Nakai, ki nima finančnega interesa v nobenem podjetju. Prav tako priporoča, da se novi člani laboratorija učijo od izkušenih oblikovalcev plazmidov; Pravi, da je to naporen, ročno izdelan proces, a če naredite napako, lahko izgubite ogromno časa in denarja.

Drugi način, da se laboratoriji izognejo težavam, je, da svoje plazmidne sekvence javno objavijo v repozitorijih z odprtim dostopom, pravi Melina Fan, glavna znanstvena direktorica neprofitne organizacije Addgene v Watertownu v Massachusettsu. Addgene zagotavlja takšno skladišče, pravi Fan, in "sekvencira deponirane plazmide in deli podatke o zaporedju prek spletne strani za uporabo v skupnosti." Preverjanje plazmidov je pomembno, dodaja.

Lahn upa, da analiza njegove ekipe pritegne pozornost raziskovalcev na dejstvo, da so ta laboratorijska orodja za delovne konje pogosto samoumevna. »Zdravje orodja je nekaj, o čemer ljudje ne razmišljajo,« pravi, čeprav bi morali.