Laboratoriekonstruerade plasmider, en arbetshäst inom modern biologi, har problem. Forskare genomförde en systematisk bedömning av cirkulära DNA-strukturer genom att analysera mer än 2 500 plasmider tillverkade i laboratorier och skickas till ett företag som tillhandahåller tjänster som att packa strukturerna i virus så att de kan användas som genterapi. Teamet fann att nästan hälften av plasmiderna hade designfel, inklusive fel i sekvenser som är avgörande för uttrycket av en terapeutisk gen. Forskarna publicerade sina resultat förra månaden på preprint-servern bioRxiv 1.

Studien avslöjar "en brist på kunskap" om att genomföra korrekt kvalitetskontroll av plasmider i laboratoriet, säger Hiroyuki Nakai, en genetiker vid Health & Science University i Oregon som inte var involverad i arbetet. Han hade redan märkt problem med labbtillverkade plasmider, men blev förvånad över frekvensen av fel som upptäcktes av studien. Det finns sannolikt många vetenskapliga artiklar som har publicerats för vilka resultaten inte är reproducerbara på grund av fel i plasmiddesign, tillägger han.

bortkastad tid

Plasmider är populära verktyg i biologiska laboratorier, som bakterier, inklusive den mycket använda modellorganismenEscherichia coli, som använder strukturer för att lagra och utbyta gener. Detta innebär att biologer kan skapa designerplasmider som innehåller olika gener av intresse, och sedanE.coliövertala dem att spela in dessa och göra många kopior av dem.

Bruce Lahn, chefsforskare på VectorBuilder, ett Chicago, Illinois-baserat företag som tillhandahåller genleveransverktyg, säger att han och andra biologer har märkt problem med plasmidkvaliteten i flera år. När Lahn var professor vid University of Chicago tillbringade en doktorand i hans laboratorium sex månader med att reproducera två plasmider som hade rapporterats i den vetenskapliga litteraturen. "Vi tänkte inte på kvaliteten på plasmiderna, men sedan fungerade inte experimentet" eftersom plasmiderna innehöll fel, säger han.

Nu på VectorBuilder säger Lahn att han ser problemet hela tiden - så han bestämde sig för att systematiskt utvärdera det. När kunder skickar in felaktiga plasmider, "slösar de mycket tid", och de extra stegen i kvalitetskontroll ökar kostnaden för att producera plasmiderna och förpacka dem till virus, säger han.

VectorBuilder-teamets analys avslöjade en mängd fel i de mer än 2 500 plasmiderna som utvärderades. Vissa innehöll gener som kodade för proteiner som ansvarar förE.colivar giftiga, vilket betyder att de kunde bromsa eller stoppa tillväxten av de organismer som biologer litar på för att replikera sina plasmider. Andra, avsedda för förpackning i virus, kodade för proteiner som var giftiga för dessa virus. Och några innehöll repetitiva DNA-sekvenser som kan ackumulera mutationer i plasmider.

Kontrollerar fel

De vanligaste felen som Lahn och hans kollegor hittade var associerade med ett nyckelverktyg för genterapi. Terapier är ofta förpackade i adenoassocierade virus (AAV), som oftast är ofarliga och kan leverera behandlingar till celler. När forskarna skapar plasmiderna för dessa AAV lägger forskarna en terapeutisk gen mellan sekvenser som kallas ITR, som spelar en avgörande roll för att säkerställa att genen packas in i viruset för leverans. Dessa sekvenser skickar i huvudsak en biologisk signal till celler som säger "Jag hör hemma i det här viruset." Emellertid fann teamet att cirka 40% av AAV-plasmiderna i studien hade mutationer i ITR-regionerna som kunde förvränga detta viktiga budskap. Om forskare använde dessa feldesignade plasmider kanske deras genterapi inte fungerar - och det kan ta lång tid för forskare att ta reda på varför.

Mark Kay, en pediatrik och genetikspecialist vid Stanford School of Medicine i Kalifornien, har också sett på egen hand att plasmidfel kan försena laboratorieprojekt. Han är dock säker på att forskare kan identifiera och korrigera dessa fel. Han säger att genterapiforskare är medvetna om möjliga ITR-problem och att fel är osannolikt i kliniska miljöer. Det beror på att tillsynsmyndigheter som US Food and Drug Administration har strikta standarder som kräver att forskare noggrant analyserar sina plasmider innan de används på kliniken.

Nakai säger att kontroll av plasmider för fel genom sekvensering kan uppmärksamma forskarna på de problem som lyfts fram i studien. Vissa företag, inklusive Plasmidsaurus i Eugene, Oregon och Elim Biopharmaceuticals i Hayward, Kalifornien, erbjuder plasmidsekvensering för cirka $15,00 per prov, säger Nakai, som inte har något ekonomiskt intresse i något av företagen. Han rekommenderar också att nya labbmedlemmar lägger tid på att lära sig av erfarna plasmiddesigners; Det är en mödosam, handgjord process, säger han, men om du gör ett misstag kan det slösa oerhört mycket tid och pengar.

Ett annat sätt för laboratorier att undvika problem är att göra sina plasmidsekvenser allmänt tillgängliga i öppna arkiv, säger Melina Fan, chief scientific officer vid ideella Addgene i Watertown, Massachusetts. Addgene tillhandahåller ett sådant förråd, säger Fan, och det "sekvenserar de deponerade plasmiderna och delar sekvensdata via webbplatsen för gemenskapsanvändning." Att kontrollera plasmider är viktigt, tillägger hon.

Lahn hoppas att hans teams analys uppmärksammar forskarna på det faktum att dessa arbetshästlabbverktyg ofta tas för givna. "Hälsan hos verktyget är något folk inte tänker på", säger han, även om de borde.